Индукция некротизирующего энтероколита в эпителиальной энтероидной модели человека

Получить крипты, полученные из ткани тонкого кишечника человека — канальцевые инвагинации, содержащие стволовые клетки и различные типы эпителиальных клеток.

Добавьте кишечные крипты в охлажденную матрицу фундамента.

Переложите эту смесь в многолуночную пластину, создав трехмерный купол.

Добавьте питательную среду и инкубируйте.

Стволовые клетки самоорганизуются, размножаются и дифференцируются в различные типы кишечных клеток, образуя энтеросферы.

Со временем энтеросферы созревают в энтероиды – трехмерные самообновляющиеся структуры, напоминающие кишечные крипты.

Добавьте липополисахариды, или ЛПС, бактериальный эндотоксин, в лунку, содержащую энтероиды, и инкубируйте.

Молекулы ЛПС связываются с толл-подобным рецептором в энтероиде, инициируя провоспалительную реакцию, приводящую к накоплению активных форм кислорода. Это запускает каскад событий, ведущих к апоптозу.

Следовательно, целостность энтероида нарушается, что приводит к проникновению ЛПС в просвет, что еще больше усиливает воспалительную реакцию.

Это имитирует развитие некротизирующего энтероколита, тяжелого воспаления в кишечнике недоношенных детей.

Во время сбора в операционном блоке поместите образец ткани тонкой кишки человека в холодный DPBS. Промойте образец в холодной DPBS до тех пор, пока он не очистится от крови и стула.

Храните образец в среде RPMI 1640 при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока он не будет готов к изоляции крипты. Когда вы будете готовы продолжить, еще раз проверьте, нет ли в образце стула и крови. С помощью деликатных ножниц для пресечения удалите лишний жир или хирургические зажимы и скобы. Взвесьте образец и стремитесь к куску весом примерно от 0,75 до 2,5 грамма.

Далее разрежьте ткань на кусочки по 0,5 сантиметра, и поместите их в пробирку, содержащую 30 миллилитров хелатирующего буфера #1. Встряхивайте на низкой скорости в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Затем отфильтруйте ткань через клеточное сетчатое фильтр с магнитной плотностью 100 микрометров и выбросьте проточный.

Добавьте отфильтрованную салфетку в пробирку, содержащую 30 миллилитров хелатирующего буфера #2. Встряхивайте на низкой скорости в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Отфильтруйте ткань через фильтр на 100 микрометров, а проточный отфильтруйте.

После этого разморозьте 500 микролитров матрицы базальной мембраны на льду для последующего использования. Добавьте немного салфетки в 10 миллилитров холодной DMEM в 50-миллилитровую коническую трубку и энергично встряхивайте рукой в течение 10 секунд. Отфильтруйте эту суспензию через 100-микрометровое сетчатое фильтр и соберите проточные. Держите эту трубку на льду.

Добавьте немного салфетки еще в 10 миллилитров холодного DMEM в отдельную 50-миллилитровую коническую трубку и энергично встряхивайте рукой в течение 10 секунд. Отфильтруйте эту суспензию через 100-микрометровое сетчатое фильтр и соберите проточные.

Повторите этот процесс еще два раза, пока не появятся четыре конические трубки, содержащие проточные трубки с маркировкой от одного до четырех. Затем отфильтруйте раствор в пробирке номер один через 100-микрометровое сетчатое фильтр и переведите поток в 15-миллилитровую коническую пробирку, также помеченную номером один. Повторите этот процесс для трубок со второй по четвертую.

Центрифугируйте 15-миллилитровые пробирки при 200 умноженных на g и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. В колпаке с ламинарным потоком удалите надосадочную жидкость из каждой трубки и выбросьте ее. Избегайте разрушения облака ткани непосредственно над гранулой, даже если для этого придется оставить некоторое количество надосадочной жидкости. В каждой пробирке медленно проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы смешать гранулу с оставшимся надосадочным веществом.

Перелейте смесь из каждой пробирки в одну 2-миллилитровую коническую пробирку и центрифугируйте при 200-кратном g и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. После этого удалите надосадочную жидкость, и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах предварительно размороженной матрицы базальной мембраны.

С помощью охлажденного наконечника для пипетки нанесите 50 микролитров этой суспензии на центр лунки в 24-луночном планшете. Этот образец должен иметь куполообразную форму. Повторите этот процесс нанесения девять раз, чтобы заполнить 10 лунок.

Перенесите 24-луночный планшет в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут, чтобы обеспечить полимеризацию. Затем добавьте в каждую лунку по 500 микролитров готовой питательной среды для человеческого мини-кишечника. Продолжайте инкубацию в тех же условиях, обязательно заменяя эту среду каждые два дня.