Сопоставление ингибирующих нейронов схем с Фотостимуляция лазерного сканирования

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании локальной функциональной организации тормозных нейронных цепей. Процедура начинается с подготовки живых срезов мозга из первичной соматосенсорной коры мышей. Следующим шагом является визуализация и запись из целевого GFP, экспрессирующего типы тормозных клеток в срезе мозга.

После этой лазерной сканирующей фотостимуляции с помощью глутамата раскалывание используется для активации небольших кластеров пресинаптических нейронов в качестве возбуждающих или тормозящих. Постсинаптические токи регистрируются в GFP, экспрессирующем интернейроны. Последним шагом является фотостимуляция, анализ данных и создание количественных карт синаптических входных данных к записанным нейронам.

В конечном счете, лазерная сканирующая фотостимуляция в сочетании с записями целых клеток позволяет построить подробные карты синаптических входов к конкретным типам тормозных нейронов, что может позволить определить организацию и функцию локальных тормозных корковых цепей. Метод, основанный на фотостимуляции, был впервые разработан доктором Ларри Кацем, Недом Кэллоуэем и в дальнейшем развит доктором Кэролсом Вабодой, моим пи, доктором Син З., обучавшимся у доктора Кэллоуэя, в Институте Солка, где он руководил многими исследованиями, изучающими межротовые схемы. В настоящее время наша группа расширяет и продолжает эти исследования, изучая внутриротовые контуры.

Чтобы начать эту процедуру, принесите в жертву трансгенную мышь в послеродовом возрасте через две-три недели путем обезглавливания и быстро удалите мозг, поместив мозг в замороженный и насыщенный кислородом раствор для резки. Затем используйте очки GFP для визуального скрининга мозга и проверки экспрессии GFP. Затем разрежьте первичную соматосенсорную кору на участки толщиной 400 микрометров с помощью вибратора.

Инкубируйте ломтики в сахарозе, содержащей ликвор с 95% O2 и 5% CO2 при температуре 32 градуса Цельсия, в течение от 30 минут до одного часа. После этого переложите срезы в обычный A CSF при комнатной температуре, чтобы лазер был готов к эксперименту, включите систему охлаждения лазера и блок питания. Затем включите все аппаратное обеспечение, связанное с управлением фотостимуляцией, включая систему сканирующих зеркал и оптический модулятор и электронный затвор, а также усилитель входного сигнала фотодиода.

Далее включается электрофизиологическое оборудование, такое как мультизажим, усилитель 700 В и микроманипуляторы. Электрофизиологическая регистрация, фотостимуляция и визуализация проводятся в камере срезовой перфузии, установленной на моторизованном предметном столике микроскопа. После этого включите камеру визуализации, срез будет визуализирован в вертикальном микроскопе с инфракрасным DIC и эпифлуоресцентной оптикой через систему визуализации.

Затем откройте программное обеспечение FS на основе MATLAB и программное обеспечение камеры захвата Q на мониторе. Перед проведением эксперимента проверьте систему лазерной фотостимуляции и убедитесь, что она находится в рабочем состоянии. Поместите лист бумаги под объектив четырехкратного микроскопа, чтобы наблюдать за диаграммой направленности лазерного сканирования во время работы системы.

Чтобы изготовить микроэлектрод с сопротивлением от четырех до шести мегаОМ, потяните стеклянный электрод с помощью съемника пипетки. Затем заполните электрод внутренним раствором, содержащим 0,1% биотина для мечения клеток и морфологической идентификации. Далее включите систему перфузии под давлением для закачки А СМЖ в камеру.

Обеспечьте постоянный уровень жидкости на 2,0 миллиметра выше среза в камере. Аликвоту исходного раствора глутамата в клетке MNI добавляют к 25 миллилитрам циркулирующего А ликвора в концентрации 0,2 миллимолярного глутамата. Затем перенесите один срез мозга в записывающую камеру.

Запустите систему визуализации, чтобы проверить качество среза и анатомически определить местоположение первичной соматосенсорной области. Затем закрепите срез с помощью изготовленного на заказ платинового кольца со струнами, и будьте осторожны, чтобы не поместить якорь над областью мозга, предназначенной для записи. Визуализируйте клетки с помощью объектива с 60-кратным увеличением на основе визуализации экспрессии GFP под флуоресцентным микроскопом DIC.

Определите и выберите типы тормозящих клеток. Обратите внимание, что запись будет осуществляться под визуальным контролем с помощью инфракрасного DIC. Видеоконтроль и переключение между режимами DIC и флуоресцентным режимами необходим для подтверждения местоположения ячейки GFP при опускании электрода к ячейке-мишени.

Использование традиционной техники зажима патчей. Сначала приложите положительное давление к электроду. Переместите его ближе к поверхности клетки, чтобы образовать заметную ямочку на целевой клеточной мембране.

Затем быстро примените отрицательное давление, чтобы сформировать гига-уплотнение и сломать ячейку, отслеживая текущую реакцию впрыска на видеомониторе. После взлома сделайте снимки записанного GFP, экспрессирующего внутринейрон при 60-кратном увеличении в режимах DIC и флуоресцентных режимов для онлайн-проверки. Перед сбором данных фотостимуляции введите импульсы гиперполяризующего и деполяризующего тока, чтобы изучить основные электрофизиологические свойства каждой клетки.

После того, как будет достигнута стабильная запись всей клетки с хорошим сопротивлением доступа, которое обычно составляет менее 20 мегаом, переключите объектив микроскопа с 60-кратного на четырехкратное увеличение для лазерной сканирующей фотостимуляции, получите изображение среза с четырехкратным увеличением и используйте его для направления и регистрации участков фотостимуляции. Задайте параметры фотостимуляции и сбора данных, активировав модуль переключения конфигурации phys. Используйте одномиллисекундный лазерный импульс мощностью около 20 милливатт с интервалом стимуляции в одну секунду.

Для картирования фотостимуляции получите следы данных за одну секунду, отобранные с частотой дискретизации 10 килогерц. Затем загрузите изображение с четырьмя x срезами в модуль маппера phys. Определите местоположение сомы и настройте участки фотостимуляции по схеме 16 на 16 с размером 80, микрометр на 80 микрометров.

Интервал вокруг места расположения клетки, который охватывает все корковые слои. Затем составьте карту профиля возбуждения записанного нейрона, исследуя места всплесков в ответ на фотостимуляцию в текущем режиме зажима. Наше удобное программное обеспечение с функциями онлайн-отображения облегчает проведение экспериментов по картографированию.

После этого нанесите на карту соединения местных возбуждающих цепей, обнаружив возбуждающие постсинаптические токи от записанной ячейки При лазерном сканировании в разных местах удерживайте ячейку при отрицательном напряжении 70 милливольт в режиме зажима напряжения, чтобы обнаружить внутренние возбуждающие токи. Затем повторите возбуждающие постсинаптические карты тока два-три раза, повернув или перевернув картину фотостимуляции. Чтобы отобразить соединения локальных тормозных цепей, обнаружите тормозящие постсинаптические токи от регистрируемой ячейки.

Удерживайте ячейку при напряжении, близком к нулю милливольт, в этом случае отрицательных 15 милливольт в режиме зажима напряжения, чтобы обнаружить внешние тормозящие токи. После завершения всех физиологических анализов аккуратно извлеките электрод из записанной ячейки. Извлеките срез мозга из камеры, затем закрепите его в 4% параформальдегиде на ночь и окрашивайте записанные клетки биотином.

В этом эксперименте комбинация экспрессии GFP, внутренней электрофизиологии и морфологических характеристик используется для классификации тормозных нейронов. Показывать. Вот пример и карта исходных данных, иллюстрирующая лазерную сканирующую фотостимуляцию, которая позволяет обширно картировать локальные корковые цепные связи с записанным тормозным нейроном. Вот примеры количественных входных карт с цветовой кодировкой, полученных из необработанных следов, только что показанных на рисунке D. Амплитуды синаптических событий, обнаруженных в записанном интернейроне, имеют цветовую кодировку и топографически накладываются на места фотостимуляции.

Расположение тела клетки обозначается красным открытым кругом на масштабной линейке. Теплые цвета указывают на сильные синаптические входы, а холодные цвета указывают на слабую связь с целевой клеткой или ее отсутствие. Аналогичным образом, на рисунке E представлено количество синаптических событий в каждой выборочной точке для записанного нейрона.

На рисунке F показано время начала первого обнаруженного синаптического события в зарегистрированной клетке после фотостимуляции в масштабной линейке. Теплые цвета указывают на короткий ввод, задержку и более холодные цвета указывают на более длительные синаптические задержки. Таким образом, LSPS позволяет строить подробные карты положения, силы, задержки и количества входов, поступающих на определенные типы тормозных нейронов.

Что ж, посещая эту процедуру, важно набраться терпения, сделать чистые условия эксперимента, но нейрон эффективно и очень осторожно переходит от большого увеличения объекта к низкому модифицированию. Затем последнее использование наземного программного обеспечения очень хорошо.