Количественная агонистично активность на G-белком рецепторы

Общая цель данной процедуры заключается в оценке относительной константы сродства KB агониста к активному состоянию рецептора путем анализа кривой зависимости ответа от концентрации. Это достигается путем предварительного измерения кривых зависимости ответа от концентрации группы агонистов, вызывающих ответ рецептора, сопряженного с G-белком. Следующим этапом процедуры является расчет значений eemax и EC 50 агонистов с помощью нелинейного регрессионного анализа.

Эти значения затем используются для расчета начальных оценок параметров для последующего нелинейного регрессионного анализа с применением операционной модели. В качестве заключительного этапа определяются относительные значения констант сродства агонистов к активному состоянию рецептора с помощью глобального нелинейного регрессионного анализа их кривых зависимости ответа от концентрации. В конечном итоге, используя модифицированную форму операционной модели, можно оценить константу сродства агониста к активному состоянию рецептора относительно константы сродства другого агониста посредством глобального нелинейного регрессионного анализа их кривых зависимости ответа от концентрации.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области разработки лекарственных препаратов, например, обладает ли агонист селективностью к конкретному сигнальному пути? Как правило, специалисты, впервые применяющие этот метод, сталкиваются с трудностями из-за особенностей математического анализа. Для оценки относительных значений KB агониста требуется серия из как минимум двух кривых зависимости ответа от концентрации агониста.

Обсуждение особенностей проведения таких экспериментов представлено в письменном протоколе. После получения кривых отклика вычтите базальный ответ из значений, измеренных в присутствии каждой концентрации агониста, и начните вносить данные экспериментов по зависимости отклика от концентрации в таблицу данных. В программном обеспечении Prism все значения логарифмов концентраций агониста вносятся в столбец с пометкой X. Показатели отклика для агониста, который, по всей видимости, имеет наибольший максимальный ответ или значение eax, вносятся в столбец A, а данные для других агонистов — в соседние столбцы, обозначенные буквами.

Введите повторные измерения кривых зависимости ответа от концентрации в подстолбцы соответствующего столбца, обозначенного буквой. Выберите лист с графиком, на котором построены данные, и выберите команду «analyze» (анализ), чтобы проанализировать данные методом нелинейной регрессии с использованием уравнения с переменным наклоном; при этом ограничьте параметр «bottom» (нижний порог) значением ноль и проведите регрессионный анализ. Запишите параметры «top» (верхний порог) и log EC 50 для последующего использования при расчете начальных оценок параметров.

Для расчета начальных оценок параметров присвойте значению log tau K observed значение отрицательного логарифма EC 50 стандартного агониста. Затем рассчитайте значение log RAI для каждого исследуемого агониста как логарифм величины, представляющей собой произведение значения eemax исследуемого агониста на EC 50 стандартного агониста, деленное на произведение значения emax стандартного агониста на EEC 50 исследуемого агониста. В данном уравнении параметры стандартного агониста обозначены апострофом.

Затем присвойте константе логарифма сродства исследуемого агониста значение отрицательного логарифма соответствующих значений EC. После ввода данных в Prism убедитесь, что данные для агониста с наибольшим значением EMAX внесены в столбец A. Данный агонист теперь назначается в качестве стандарта, в то время как остальные агонисты определяются как исследуемые агонисты. Далее введите в Prism пользовательское уравнение log, RAI на нескольких строках.

В данном случае пользовательское уравнение включает в себя в общей сложности пять агонистов. Введите начальные оценки параметров рецептора R и константы сродства исследуемых агонистов. Для M sis назначается значение EMAX стандартного агониста, а для M — значение один.

Теперь введите начальные оценки параметров значений log RAI для исследуемых агонистов. Примените ограничения параметров, установив log K₁ равным нулю, а значения log GR, m, sis и M — одинаковыми для всех наборов данных. Затем запустите нелинейный регрессионный анализ.

Для оценки значений KB агонистов в абсолютных единицах (обратных молярных единицах) используются клеточные анализы in vitro, характеризующиеся конститутивной активностью рецептора, что позволяет получить наблюдаемые значения log K и log RAI исследуемых агонистов. Выберите агонисты и спланируйте эксперимент в соответствии с письменным протоколом. Рассчитайте конститутивную активность рецептора и ответ на каждую концентрацию агониста как разность между измеренным ответом и базальным ответом в клетках, не трансфецированных рецептором; здесь представлены ответы на различные агонисты, рассчитанные таким образом для сигнального пути с очень низкой конститутивной активностью для предварительного анализа.

Сначала введите данные в программу Prism, как описано для неконститутивной активности. Нажмите «Accept». Также введите ответ, вызванный конститутивной активностью рецептора, в соответствующие буквенные столбцы в строке, соответствующей логарифму концентрации агониста -20. В данном случае вводится большое отрицательное значение логарифма для аппроксимации нулевой концентрации агониста.

Проведите анализ данных так же, как и ранее, за исключением того, что для конститутивной активности параметр bottom должен быть ограничен таким образом, чтобы быть общим для всех наборов данных. Зафиксируйте значение общего параметра, а также параметры top и log EC для каждого агониста. После определения константы log affinity стандартного агониста в отдельных экспериментах рассчитайте начальную оценку значения log K observed для каждого исследуемого парциального агониста как логарифм выражения, состоящего из разности между значением emax стандартного агониста и исследуемого агониста, деленной на произведение EC 50 и разности между значением eemax стандартного агониста и конститутивным ответом.

Рассчитайте начальную оценку log KB для каждого агониста и начальную оценку log T cis для определения значений KB агонистов. Введите данные в Prism, затем введите пользовательское уравнение. Введите значения Log KB в Prism на нескольких строках, как показано здесь для случая с двумя агонистами.

Затем введите начальные оценки параметров, указав значения аффинности для каждого агониста. Для оценки log T s и оценки M s присваивается значение EMAX стандартного агониста, а для M присваивается значение один. В завершение введите начальные оценки log kb.

Примените ограничения параметров, зафиксировав значение log K1 на ранее определенном уровне и установив общие значения log Tsis, msis и M для всех наборов данных. Запустите нелинейный регрессионный анализ. В результате будут получены значения log KB стандартного агониста, log K наблюдаемого, а также значения log KB парциальных агонистов.

Максимальный ответ системы, значение log T cys для свободного рецепторного комплекса и коэффициент наклона трансдуктора в представленной операционной модели — это вызванный мускариновыми агонистами гидролиз фосфоинозитидов в клетках яичника китайского хомячка, стабильно экспрессирующих мускариновый рецептор M3. В данном анализе были измерены кривые концентрационной зависимости для выбранных мускариновых агонистов, и данные были проанализированы, как описано здесь, для оценки значения KB каждого агониста относительно значения для Oxo Tremaine M. Теоретические кривые представляют собой аппроксимацию данных по методу наименьших квадратов с использованием уравнения регрессии. Оценки log RAI приведены для kabale, a recline, пилокарпина и McNeil.

A 3, 4 3. Были определены соответствующие оценки максимального отклика системы и коэффициента наклона преобразователя. Также были найдены наблюдаемые значения log K для каждого из представленных агонистов.

Ниже представлены результаты экспериментов по стимуляции гидролиза фосфоинозитидов мускариновыми агонистами в клетках HC 2 93. Транзиентная экспрессия мускаринового рецептора M three в клетках со стабильной экспрессией G alpha 15 вызвала повышение базального гидролиза фосфоинозитидов, что было обусловлено конститутивной активностью рецептора. Данные были проанализированы для оценки значений log KB Oxo Tremaine M и MacNeil, A 3 43.

Теоретические кривые представляют собой аппроксимацию данных по методу наименьших квадратов для уравнения регрессии. Приведены оценки log KB для Oxo Tremoring M и McNeil, A 3 43. Также было определено значение K observed для McNeil A 3 43.

При должном навыке данный метод анализа данных занимает всего несколько минут. После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как оценивать как относительные, так и фактические значения KB по кривым зависимости ответа от концентрации агонистов, вызывающих ответ ниже по каскаду в сигнальном пути рецептора, сопряженного с G-белком.