Прогнозирование ВИЧ-1 корецепторов использования (тропизм) анализом последовательности использования Генотипическая подход

Общая цель следующего эксперимента заключается в прогнозировании использования ко-рецепторов ВИЧ-1 для назначения нового класса антиретровирусных препаратов. Это достигается путем выделения вирусных геномных нуклеиновых кислот, вирусной РНК или провирусной ДНК из крови пациента с последующей амплификацией области оболочки. Вирусная область V3, которая является основным детерминантом тропизма, амплифицируется с помощью вложенной ПЦР.

Затем проводится секвенирование ампликона V3 с использованием различных праймеров для создания файла формата fasta. Полученные результаты демонстрируют вирусный тропизм и чувствительность к антагонистам корецепторов на основе частоты ложноположительных результатов (FPR), рассчитанной с помощью онлайн-инструмента интерпретации geno to pheno coreceptor. В зависимости от используемого корецептора вирусы ВИЧ классифицируются как R5 или X4.

Маравирок связывается с рецептором CCR5, подавляя проникновение R5-вирусов в клетку-мишень. В ходе заболевания могут появиться и начать преобладать X4-вирусы. Поэтому перед применением маравирока, согласно требованиям EMA и FDA, обязательно определение тропизма, то есть специфичности использования рецепторов.

Основное преимущество данного метода заключается в том, что можно очень легко провести параллельное определение устойчивости к другим классам антиретровирусных препаратов. Этот метод позволяет обеспечить гораздо более персонализированный подход к лечению, так как пороговые значения результатов тропизма могут быть изменены в соответствии с потребностями пациента. Идея этого метода возникла у нас в начале девяностых, когда мы хотели изучить молекулярную основу различий в росте культур клеток при заражении различными штаммами ВИЧ и прогрессировании заболевания у пациентов; процедуру будет демонстрировать технический специалист нашей группы до начала данного протокола.

Образцы крови с ЭДТА собирают в клиническом центре и направляют в лабораторию для выделения нуклеиновых кислот ВИЧ из 1000 µL сыворотки или плазмы цельной крови с использованием системы MagPure Compact и набора для выделения нуклеиновых кислот согласно инструкциям производителя. Полученные РНК или ДНК растворяют в 50 µL ТЕ-буфера. Следующим этапом является амплификация области оболочки нуклеиновой кислоты с помощью ОТ-ПЦР для РНК или обычной ПЦР для ДНК, как описано в тексте; в результате реакции должен быть получен продукт длиной 1 245 пар оснований, охватывающий большую часть области белка оболочки. Для амплификации области V3 белка оболочки проводят вложенную ПЦР, используя 5 µL продукта первой ПЦР-реакции в качестве матрицы.

Подготовьте реакционные смеси, используя мастер-микс для вложенной ПЦР собственного производства, как описано в тексте. Параметры проведения вложенной ПЦР также указаны там. После амплификации области V3 проанализируйте ПЦР-продукт методом гель-электрофореза, чтобы подтвердить наличие ожидаемого продукта длиной 902 п.н., прежде чем приступать к секвенированию.

Очистите продукт ПЦР в соответствии с описанным письменным протоколом. После очистки продукта ПЦР проведите реакцию секвенирования согласно инструкциям в тексте. По завершении реакции очистите образцы для секвенирования, используя cidex G 50 superfine и многослойную фильтрационную пластину с мембраной durapore, следуя указаниям в письменной части данной процедуры. Для секвенирования очищенного продукта подготовьте секвенатор, проверив уровень полимера и заменив буфер.

Затем загрузите образцы, установите условия и запустите процесс. После завершения секвенирования можно использовать программу DNA STAR laser gene для выравнивания и редактирования последовательностей.

Ампликон V3 секвенируют с использованием как минимум одного прямого и одного обратного праймеров. Программа Laser Gene выравнивает файлы ABI, полученные с секвенатора, по референсным последовательностям. V3, consensus B и envelope laser gene создают консенсусную последовательность анализируемого образца, используя все доступные необработанные данные, но без учета референсов, и сохраняют её в формате файла FASTA.

Файл FASTA представляет собой текстовый файл, который содержит заголовок с названием образца и нуклеотидную последовательность. Чтобы начать интерпретацию данных и прогнозирование тропизма, загрузите файл FASTA в веб-систему интерпретации. Geno Tono co-receptor выберите порог FPR, при котором вирус классифицируется как R five.

Согласно немецким рекомендациям, вирус классифицируется как R5, если FPR больше или равен 20%, и как X4, если FPR составляет менее 12,5%. Выберите любые дополнительные клинические параметры, если они доступны, затем выберите «align and predict» (выровнять и предсказать). Этот сервер переводит нуклеотидную последовательность в аминокислоты, выравнивает ее с консенсусной последовательностью V3 B и определяет подтип. Кроме того, он генерирует прогноз использования ко-рецептора, выраженный в виде FPR.

Результат представляет собой дифференцированную интерпретацию, зависящую от вероятности использования ко-рецептора. При высоких значениях FPR можно быть уверенным, что вирус не является X four, а при низких значениях FPR интерпретация, текст и цвет фона будут зелеными, что означает неопределенность в отношении характеристик вируса. Зеленый цвет указывает на безопасность применения Ravi Rock, желтый — на возможный низкий риск при использовании Ravi Rock, а красный означает, что Ravi Rock не следует назначать.

Кроме того, сервер создает PDF-отчет, который можно распечатать и отправить врачу. Дополнительные данные, такие как имя пациента или дата забора крови, могут быть добавлены вручную с помощью программы для работы с PDF-файлами. Также на личном компьютере пользователя можно добавить специальные примечания.

После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как определять вирусные тропизмы с помощью инструмента geno pheno receptor. При выполнении данной процедуры важно регулярно проводить контроль качества. Не забывайте, что работа с ВИЧ может быть крайне опасной, поэтому необходимо всегда соблюдать меры предосторожности и использовать сертифицированные лаборатории с соответствующим уровнем биологической безопасности.