Прогнозирование ВИЧ-1 корецепторов использования (тропизм) анализом последовательности использования Генотипическая подход

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы предсказать использование ко-рецептора HIV one для введения нового класса антиретровирусных препаратов. Это достигается путем выделения вирусных геномных нуклеиновых кислот, вирусной РНК или провирусной ДНК из крови пациента после амплификации области оболочки. Вирусная область V 3, которая является основным фактором, определяющим тропизм, амплифицируется с помощью вложенной ПЦР.

Затем ампликон V 3 секвенируется с различными праймерами для создания файла fasta. Получены результаты, которые показывают вирусный тропизм и восприимчивость к антагонистам корецепторов на основе ложноположительного результата или FPR, полученного с помощью онлайн-инструмента интерпретации гено к фенокорецептору. В зависимости от использования КОРЕРЕЦЕПТОРа, вирусы ВИЧ классифицируются как R 5 или X 4.

Горная порода мири связывается через рецептор CCR 5, препятствуя проникновению вирусов R 5 в клетку-мишень. В течение болезни X четыре вируса могут возникать и перерастать вирусы R 5. Поэтому прекращение использования рецепторов, также называемое тропизмом, является обязательным перед введением маравирока в соответствии с требованиями EMA и FDA.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что можно очень легко проводить параллельное определение резистентности к другим классам антиретровирусных препаратов. Этот метод позволяет использовать гораздо более персонализированную медицину, поскольку пороговые значения для результатов тропизма могут быть изменены в соответствии с потребностями пациента. Впервые идея этого метода возникла у нас в начале девяностых годов, когда мы хотели узнать молекулярную основу роста различных клеточных культур штаммов ВИЧ и прогрессирование заболевания у пациентов, демонстрируя эту процедуру.

Образцы собираются в виде крови ЭДТА в клиническом центре и отправляются в лабораторию для начала выделения нуклеиновых кислот ВИЧ из 1000 микролитров сыворотки или плазмы цельной крови с использованием компактной системы mag pure и набора для выделения нуклеиновых кислот в соответствии с инструкциями производителя. Затем полученная РНК или ДНК помещается в 50 микролитров TE-буфера. Следующим шагом является амплификация области оболочки нуклеиновой кислоты методом ПЦР с обратной транскрипцией для РНК или просто ПЦР для ДНК, как описано в тексте, реакция должна получить продукт длиной 1 245 пар оснований, содержащий большую часть области белка оболочки, для амплификации области V трех белков оболочки с последующей вложенной ПЦР с использованием пяти микролитров из первой реакции ПЦР в качестве матрицы.

Подготовьте реакции с использованием мастер-смеси для вложенной внутренней ПЦР, как описано в тексте. Там же описаны параметры работы вложенной ПЦР. После амплификации области V three проанализируйте продукт ПЦР, чтобы проверить ожидаемый продукт на длине пары оснований 902 с помощью гель-электрофореза перед секвенированием.

Очистите продукт ПЦР так, как описано в письменном протоколе. После того, как продукт ПЦР будет очищен, выполните реакцию секвенирования, как описано в тексте, после завершения реакции. Очистите образцы для секвенирования с помощью cidex G 50 сверхтонкого и многосетчатой фильтрующей пластины с мембраной durapore, следуя инструкциям в письменной части данной процедуры для секвенирования очищенного продукта, подготовьте секвенатор путем проверки полимера и замены буфера.

Затем загрузите сэмплы, задайте условия и запустите прогон. После прогона секвенирования. Лазерная генная программа DNA STAR может быть использована для выравнивания и редактирования последовательностей.

Ампликон V-трех секвенирован по меньшей мере с одним прямым и одним обратным праймером. Лазерный ген выравнивает ABI-файлы, полученные от секвенатора, с референсными последовательностями. V 3, консенсус B и ген огибающего лазера создают консенсусную последовательность анализируемого образца, используя все доступные исходные данные, но не ссылки, и сохраняют ее в виде файла FASTA.

Файл FASTA представляет собой текстовый файл, который включает в себя заголовок с именем образца и нуклеотидной последовательностью. Чтобы начать интерпретацию данных и прогнозирование тропизма, загрузите файл FASTA в веб-систему интерпретации. Корецептор Geno Tono выбирает порог FPR, до которого вирус классифицируется как R пять.

Согласно немецким рекомендациям, вирус классифицируется как R пять. Когда FPR больше или равно 20% и как X четыре, когда FPR меньше 12,5%, выберите любые дополнительные клинические параметры, если они доступны, а затем выберите, выровняйте и предскажите. Кроме того, он генерирует прогноз использования корецептора, выраженный в виде FPR.

Выходные данные показывают градуированную интерпретацию в зависимости от вероятности использования корецептора. При высоких значениях FPR можно быть совершенно уверенным, что вирус не имеет X четыре, а при низких значениях FPR невозможно понять, как выглядит вирус, если интерпретация, текст и цвет фона зеленые. Рекомендуется безопасное применение Ravi Rock, в то время как желтый указывает на возможный низкий риск использования Ravi Rock, а красный указывает на то, что Ravi Rock не следует назначать.

Кроме того, сервер генерирует отчет в формате PDF, который можно распечатать и отправить врачу. Дополнительные данные, такие как имя пациента или дата забора крови, могут быть включены вручную с помощью программы записи PDF. В целях конфиденциальности компьютера пользователя также могут быть добавлены конкретные комментарии.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как определить вирусные отбивные с помощью инструмента генорецепторов фенорецепторов. Не забывайте, что работа с ВИЧ может быть чрезвычайно опасной, поэтому всегда следует использовать меры предосторожности и авторизованные биологически безопасные лаборатории.