Хронический Сужение седалищного нерва и боль Гиперчувствительность тестирования у крыс

Общая цель данной процедуры — выполнение хронической констрикции (сдавливания) седалищного нерва, которая является широко используемой моделью нейропатической боли у грызунов, и количественная оценка результирующего болевого поведения. Это достигается путем первоначального наложения четырех лигатур из хромированной кишки вокруг обнаженного седалищного нерва на уровне середины бедра для создания компрессионного повреждения нерва. Затем в заданные моменты времени проводится мониторинг болевого поведения задней лапы путем количественного измерения порога отдергивания лапы при механическом воздействии с помощью эстзиометра von Frey и латентности отдергивания лапы при термическом воздействии с помощью плантарного анализатора боли.

В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие наличие механической и термической боли, а также гиперчувствительности поврежденной задней лапы путем измерения вызванных реакций отдергивания на механические и термические стимулы. Этот метод повреждения периферических нервов, впервые разработанный bene и Z, может помочь ответить на ключевые вопросы в области хронической боли, такие как механизмы периферического и центрального генеза нейропатической боли. Значимость данной методики распространяется на терапию нейропатической боли, поскольку эта модель обеспечивает основу для изучения новых стратегий снижения болевой гиперчувствительности.

Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями, так как наложение швов на кишечник cmic вокруг неподвижного нерва и достижение подходящей степени натяжения для нанесения достаточной, но не чрезмерной травмы нерва представляет собой сложную задачу. Перед началом процедуры продезинфицируйте рабочую поверхность 70% ethanol и подготовьте стерильные инструменты, марлю, скобы и тампоны, прошедшие предварительное автоклавирование. Затем проведите анестезию крысы в индукционной камере с использованием 5% ISO fluorine.

В течение операции подавайте 2% ISO фторэтаном через специально изготовленную лицевую маску. После этого выбрейте шерсть на левой задней конечности крысы, затем поместите животное на терморегулируемый нагревательный мат при температуре 37 °C. Нанесите на глаза смазывающую офтальмологическую мазь.

Затем подготовьте хромированный кетгут, разрезав его на небольшие фрагменты длиной около трех сантиметров, и погрузите их в стерильный физиологический раствор. Далее стерилизуйте выбритую область, трижды поочередно обрабатывая ее спиртом и раствором йода. Положив животное на грудную клетку, приподнимите левую заднюю конечность и зафиксируйте бедренную кость под углом 90 градусов к позвоночнику, прикрепив стопу с помощью маскировочной ленты.

Затем сделайте разрез кожи примерно на три-четыре миллиметра ниже бедренной кости. Отделите кожу от мышц вокруг разреза, рассекая соединительную ткань. Используя тупоконечные ножницы, рассеките соединительную ткань между поверхностной ягодичной мышцей (gluteus superficialis) и двуглавой мышцей бедра (biceps fems).

Затем с помощью ретрактора расширьте пространство между двумя мышцами для обеспечения четкой визуализации седалищного нерва, после чего с помощью пинцета и микроножниц осторожно освободите примерно 10 миллиметров седалищного нерва от окружающей соединительной ткани. Завяжите первую лигатуру проксимальнее трифуркации седалищного нерва для каждой лигатуры. Начните с одной свободной петли.

Затем захватите два конца лигатуры рядом с петлей и потяните их до тех пор, пока петля не будет плотно затянута и лигатура перестанет скользить вдоль нерва. Удерживая петлю в правильном положении, наложите вторую петлю поверх первой, чтобы завершить завязывание узла. Затем обрежьте свободные концы лигатуры так, чтобы сдавление нерва в пределах одного миллиметра было минимальным.

Повторите эти действия для остальных трех лигатур, завязывая каждую последующую лигатуру на один миллиметр проксимальнее предыдущей. В конце операции, обеспечив минимальное сжатие, сшейте мышечный слой с помощью швов и зафиксируйте кожу скобами. Затем обработайте рану раствором йода для стерилизации.

Внимательно наблюдайте за животным в период выхода из наркоза;recovery и оставьте его восстанавливаться в отдельной клетке с плоским бумажным наполнителем. Перед началом эксперимента в течение нескольких дней ежедневно проводите манипуляции с животным для привыкания.

Затем перед проведением поведенческого тестирования приучите крысу к помещению. Среда для тестирования должна быть тихой и строго контролируемой, с постоянными уровнями температуры и влажности, а каждая сессия тестирования должна проводиться в одно и то же время суток. Для изучения порога механического отдергивания в день тестирования поместите крысу в тестовую клетку с приподнятым сетчатым полом за 15–30 минут до начала эксперимента; используя динамический плантарный von fray, расположите блок стимулятора касания с нитью непосредственно под серединой подошвенной поверхности задней лапы и нажмите клавишу пуска.

Это приподнимает волокно для механического воздействия на подошвенную поверхность задней лапы с нарастающей силой. Затем зарегистрируйте порог механического отдергивания как для поврежденной, так и для неповрежденной задней лапы. Данный прибор автоматически регистрирует и отображает максимальную силу, приложенную в момент реакции отдергивания.

Повторите механическую стимуляцию трижды с интервалом около пяти минут между стимулами, протестировав неповрежденные задние лапы в сбалансированном порядке, а затем рассчитайте среднее значение порогов отдергивания лапы. Для изучения латентного периода термического отдергивания в день тестирования поместите крысу в клетку стеклянным дном за 15–30 минут до начала эксперимента. С помощью прибора для анализа термической алгезии подошвы расположите инфракрасный источник непосредственно под центральной поверхностью подошвы задней лапы и нажмите клавишу пуска.

Таким образом, подошвенная поверхность задней лапы подвергается воздействию луча теплового излучения через прозрачную стеклянную поверхность. Затем фиксируют латентный период отдергивания обеих задних лап — поврежденной и неповрежденной. Данный прибор автоматически регистрирует время от начала теплового стимула до отдергивания лапы от источника тепла.

Повторите тепловую стимуляцию не менее трех раз с интервалом около пяти минут между стимулами, тестируя поврежденную и неповрежденную задние лапы в сбалансированном порядке, а затем рассчитайте среднее значение латентного периода отдергивания лапы. Здесь показан порог механического отдергивания для поврежденных и неповрежденных лап крыс Wistar до и в течение 12 дней после хронического сдавления седалищного нерва. Наблюдается значительное снижение порога отдергивания лапы в ответ на механические стимулы в поврежденной ипсилатеральной задней лапе по сравнению с неповрежденной контрлатеральной задней лапой. Здесь представлена латентность теплового отдергивания для поврежденных и неповрежденных лап до и в течение 12 дней после хронического сдавления седалищного нерва.

Аналогичным образом, латентный период отдергивания при воздействии температуры значительно сокращается в поврежденной ипсилатеральной задней лапе по сравнению с неповрежденной контралатеральной задней лапой. После освоения методики операция CCI может быть выполнена всего за 20 минут на одно животное, что приводит к развитию долгосрочной гиперчувствительности задней лапы к боли. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости неплотного завязывания лигатур, так как именно самопережатие под лигатурами вследствие развития отека приводит к последующему сдавливанию.

Данный метод повреждения периферических нервов в сочетании с тестированием гиперчувствительности к боли (P-волна) предназначен для исследователей в области нейропатической боли с целью изучения механизмов, лежащих в основе хронической боли, вызванной повреждением нерва.