Эффективное производство рекомбинантных парвовирус с помощью аденовируса производные системы

Общая цель данной процедуры заключается в получении рекомбинантных парвовирусов (rec PVS) с высокими титрами при сохранении их качества, сокращении времени и стоимости производства. Это достигается путем первоначального создания стока рекомбинантного парвовируса посредством трансфекции клеток HEC 2 93 T плазмидами rec PV совместно с вектором на основе аденовируса 5-го типа. Введение геномных элементов аденовируса в клетки HEC 2 9 3 T увеличивает выход rec PVS более чем в десять раз.

В сравнении с существующими протоколами был создан новый хелпер AD VP, содержащий геномные аденовирусные элементы, необходимые для повышения продукции рекомбинантного парвовируса, а также генную единицу VP парвовируса. Следующим шагом является получение и очистка этого нового хелпера ADD VP в соответствии со стандартными протоколами.

Заключительным этапом данной процедуры является амплификация рекомбинантных PVS-вирусов путем совместного заражения клеток NB three 20 4K рекомбинантным PV и вирусом AD ADP. Эффективность продукции рекомбинантного PV при использовании этой стратегии повышается более чем в 100 раз; данный метод может быть применен исключительно после получения небольшого количества рекомбинантных PVS-вирусов посредством трансфекции. В конечном итоге для титрования полученных вирусных стоков используется количественная ПЦР в реальном времени или анализ трансдукции.

Кроме того, проводится анализ бляшек, чтобы подтвердить, что в процессе производства не были созданы нежелательные репликативно-компетентные вирусы. Основным преимуществом этого метода перед существующими, такими как классическое производство рекомбинантного парвовируса с помощью плазмид, трансфекции и обработки клеток, является то, что после получения исходных стоков рекомбинантного парвовируса с помощью аденовирусного хелпера VP наше производство будет полностью полагаться на вирусное заражение. Это позволяет использовать клетки NBK, которые являются хорошими продуцентами парвовируса, но плохо поддаются трансфекции.

Таким образом, становится возможным амплифицировать рекомбинантные вирусы и увеличить общий титр вируса более чем в 100 раз, сокращая время и стоимость производства. Процедуру продемонстрирует Барбара Лоик, руководитель отдела производства вирусов, которая разработала этот новый протокол вместе с нами. Надеемся, что вам понравится это видео, и желаем вам удачи в ваших экспериментах.

Для получения минимального количества рекомбинантного парвовируса (rec PV), который послужит инокулятом для последующего производства rec PV методом инфицирования, необходимо произвести рекомбинантный парвовирус путем трансфекции. Для производства rec PV за один день до трансфекции требуется лаборатория второго уровня биологической безопасности (BSL-2). Посейте 2 миллиона клеток HEC 2 9 3 T в чашку диаметром 10 сантиметров, чтобы достичь 50% конфлюэнтности клеток.

В день трансфекции вырастите клетки в 10 миллилитрах среды DMEM, дополненной 10% FBS, L-глутамином, пенициллином и стрептомицином; инкубируйте в течение ночи при 37 °C в атмосфере с 5% CO2 и влажностью 92%. В день трансфекции приготовьте смесь для получения вируса в пробирке объемом 1,5 мл. Добавьте следующие реагенты в молярном соотношении 1:2:1 — 3 мкг рекомбинантного PV-вектора, содержащего интересующий трансген.

Шесть микрограмм вектора P-C-M-V-V-P, содержащего единицу гена капсида парвовируса, и восемь микрограмм вспомогательной плазмиды, производной от аденовируса. Разведите смесь плазмид безсывороточной средой до объема 850 мкл, чтобы получить конечную концентрацию 20 нг/мкл. Затем добавьте 42,5 мкл реагента для трансфекции FU gene HD в соотношении реагента FU gene к ДНК 2,5:1.

Следите за тем, чтобы реагент с геном FU не касался стенок пробирки; осторожно перемешайте смесь на вортексе в течение 5–10 секунд, затем инкубируйте трансфекционную смесь при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавьте трансфекционную смесь к клеткам по каплям. Осторожно встряхните планшет для равномерного распределения смеси.

Инкубируйте планшет в течение 72 часов при 37 °C в атмосфере с 5% CO2 и влажностью 92%. В течение этого периода из плазмид парвовируса формируются дочерние частицы парвовируса для последующего сбора вируса. Сначала соскребите клетки вместе с культуральной средой, затем аспирируйте и перенесите суспензию с планшета в пластическую пробирку объемом 15 мл.

Центрифугируйте пробирку при 250 G в течение пяти минут. При комнатной температуре удалите 95% супернатанта, оставив около 0.5 миллилитров. Осторожно перемешайте содержимое пробирки на вортексе, чтобы ресуспендировать осадок в оставшемся супернатанте, и перенесите в пробирку типа «эппендорф» объемом 1.5 миллилитра.

Заморозьте суспензию в ванночке с жидким азотом, а затем разморозьте в теплой воде при температуре 37 °C. Интенсивно перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение 15 секунд. Повторите цикл замораживания-оттаивания еще два раза.

Центрифугируйте пробирку при 16 000 G в течение 15 минут при температуре четырех градусов Цельсия, затем перенесите супернатант в новую пробирку. Супернатант на данном этапе содержит грубый экстракт вируса, который может быть использован в качестве инокулята для получения рекомбинантного PVS путем инфицирования. Наращивание вируса.

Репликация вируса зависит от клеточных факторов, которые экспрессируются в пролиферирующих клетках. Следовательно, важно, чтобы клетки, используемые для производства рекомбинантного вируса, находились в оптимальном состоянии и были высеяны с подходящей плотностью, как показано в данном протоколе. За один день до инфицирования высейте 10 миллионов клеток MBthree 20 4K в флакон T 1 75, чтобы на следующий день достичь 60–80% конфлюэнтности клеток.

Подготовьте второй флакон с таким же количеством клеток в качестве контроля. В каждом флаконе T 1 75 утром в день заражения должен быть конечный объем MEM 20 milliliters с добавлением 5%FBS, L-глутамина, пенициллина и стрептомицина. Приготовьте вирусную смесь в пластиковой пробирке объемом два миллилитра.

Добавьте эти реагенты. Добавьте вспомогательный белок VP. Добавьте рекомбинантный PVS с множественностью заражения 10 при MOI 0,5 и MEM до объема 1,5 миллилитров.

Перенесите всю вирусную смесь в один из флаконов T 1 75. Инкубируйте флакон в течение двух часов при 37 °C, влажности 92% и 5% CO2, аккуратно встряхивая каждые 15 минут. Продолжите инкубацию еще в течение 20–24 часов при 37 °C, влажности 92% и 5% CO2.

Через 20–24 часа замените культуральную среду на свежую и инкубируйте колбу в тех же условиях в течение 48 часов для обеспечения эффективного производства вируса. В колбе с клетками, инфицированными вирусом, должны наблюдаться явные признаки цитотоксичности. Через 36–48 часов после инфицирования (по истечении 48 часов инкубации) аспирируйте супернадант среды из колбы и перенесите его в центрифужную пробирку объемом 50 мл.

Дважды промойте клетки 1,5 миллилитрами PBS, инкубируйте с трипсином в течение трех-пяти минут, а затем добавьте суспензию клеток к удаленной среде; центрифугируйте клетки и супернатант при 5 000 G в течение пяти минут при комнатной температуре, удалите супернатант и добавьте один миллилитр буфера TE к осадку клеток. Осторожно перемешайте содержимое пробирки на вортексе для ресуспендирования клеток. Затем заморозьте клеточную суспензию в ванне с жидким азотом и разморозьте в теплой воде при 37 °C.

Интенсивно перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение 15 секунд. Повторите цикл замораживания-оттаивания три раза. Затем обработайте клеточную суспензию нуклеазой Ben Nase в течение 30 минут при 37 °C для расщепления геномной ДНК клеток и неинкапсулированной вирусной ДНК.

Через 30 минут центрифугируйте пробирку при 5 000 G в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия. В конце соберите супернатант в новую пробирку. Супернатант на данном этапе представляет собой неочищенный вирусный экстракт.

Типичные выходы рекомбинантного PV GFP, полученные по данному протоколу, должны находиться в диапазоне от 1 до 10 × 10⁸ инфекционных вирусных единиц. Здесь представлен пример стимуляции продукции рекомбинантного PV с помощью плазмиды на основе аденовируса. Неочищенные экстракты вируса, содержащие PHH one GFP рекомбинантный PV с геном GFP или без него.

Плазмиды PXX на основе аденовируса были введены в индикаторные клетки NBK; как видно на этих микрофотографиях, в присутствии PXX six наблюдается большее количество GFP-положительных клеток. При проведении анализов на трансдукцию GFP было зафиксировано явное увеличение продукции рекомбинантного PV в присутствии Pxx six. Объем продукции увеличился с 0,3 единиц трансдукции GFP или TU на клетку, полученных по стандартным протоколам, примерно до пяти TU на клетку при использовании данного протокола.

Результаты анализа трансдукции GFP указывают на то, что гены аденовируса E2a, E4 и VA RNA, содержащиеся в PXX6, способны повышать продукцию парвовируса. На следующем рисунке представлен репрезентативный пример продукции рекомбинантного PV путем инфицирования. Клетки NB3 20 4K были инфицированы очищенным хелперным вирусом ADP, а затем повторно инфицированы одним из двух рекомбинантных парвовирусов.

Грубые клеточные экстракты использовали для определения титров вируса с помощью анализа трансдукции, который показал, что вспомогательный белок AD VP дополнительно повысил продукцию rec PV до значений более 70 T на клетку. Наконец, партии вируса, полученные в присутствии или в отсутствие ADP, анализировали на содержание репликативно активных вирусных частиц с помощью метода определения бляшек на индикаторных клетках MB three 20 4K. Результаты указывают на то, что вспомогательный белок ADP повысил продукцию rec PV, не увеличивая появление нежелательных репликативно активных вирусных частиц после его разработки.

Данный метод позволяет ученым, работающим в области терапии рака и генной терапии, дополнительно масштабировать производство рекомбинантных вирусных векторов. С помощью биореакторов можно получать варианты в больших количествах, необходимых для применения в клинических условиях.