Количественная грибковой колонизации, спорогенеза, и производство микотоксинов Использование ядра Биопробы

Общая цель этой процедуры заключается в точной количественной оценке биосинтеза, порчи и роста микотоксинов для изучения молекулярных взаимодействий грибов семян. Это достигается путем предварительной настройки биоанализа ядра. Далее перечисляются кедии, затем количественно оцениваются микотоксины.

Наконец, измеряется биомасса гриба. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают влияние физиологии семян на размножение, развитие и вторичный метаболизм микотоксичных грибов путем количественного определения биомассы кедии и вторичных метаболитов с использованием методов подсчета спор в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией. Основное преимущество распространения этого метода заключается в стандартизации методов в нескольких лабораториях, чтобы результаты из разных лабораторий можно было перекрестно интерпретировать.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия молекулярных микробов семян, таких как способ, с помощью которого патогенные грибы захватывают метаболизм липидов растений в качестве вирулентной стратегии. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что разные штаммы анги демонстрируют разный рост и модели развития. Поэтому крайне важно, чтобы вы оптимизировали условия для взаимодействия ваших любимых грибных семян за две недели до выполнения лабиринта.

Культура биопроб ядра. Грибковые патогены на картофельной декстрозе, агаре или КПК, при температуре 28 градусов Цельсия. Когда все будет готово, выберите ядра, похожие по возрасту, форме и размеру, и поместите их в 50-миллилитровые пробирки. Поверхность.

Стерилизуйте ядра, добавив 70% этанола и встряхивая трубки при комнатной температуре в течение пяти минут. Далее взболтать со стерильной водой в течение одной минуты и с 6%-ным гипохлоритом натрия в течение 10 минут. Смыть стерильной водой три раза с встряхиванием по пять минут каждый.

Затем промокните ядра насухо на автоклавных полотенцах, чтобы заразить Aspergillus flavus. С помощью иглы 18 калибра создайте небольшую рану глубиной 0,5 сантиметра на стороне эмбриона каждого ядра. При заражении fusarium vertices используйте лезвие бритвы, чтобы сделать надрез глубиной 0,5 миллиметра.

Приготовьте суспензию инокулята, добавив в культивируемые тарелки пять миллилитров автоклава 0,1%-ного раствора 20, и с помощью разбрасывателя клеток соскребите споры. Удаляйте мицелий под действием силы тяжести, процеживая раствор не менее чем через четыре слоя автоклавной марли. Используйте гемоцитометр для расчета концентрации спор и отрегулируйте их так, чтобы они соответствовали шести спорам на миллилитр.

Для обоих видов грибов. Создайте камеру влажности в пластиковой емкости, выстелив ее пятью листами бумажных полотенец и добавив 100 миллилитров стерильной воды. Затем поместите по четыре ядра в каждый автоклав.

20 миллилитровый стакан в монтажный флакон. Взвесьте их и запишите их массу. Добавьте по 200 микролитров споровой суспензии в крышку каждого флакона и вортекс, чтобы равномерно покрыть ядра суспензией.

Затем ослабьте крышки, чтобы обеспечить свободный воздухообмен, и поместите флаконы в камеру влажности. Инкубируйте ядра при 12-часовом светлом 12-часовом темном фотопериоде при температуре 28 градусов Цельсия в течение семи дней или до желаемого После периода заражения добавьте пять миллиметров автоклава 0,01% между 20 в симуляционные флаконы, содержащие зараженные ядра, и тщательно перемешайте в течение одной минуты. С помощью широкого наконечника пипетки VRE немедленно разбавьте споровую суспензию, переложив две отдельные аликвоты по 200 микролитров в две миллилитровые эйноровые пробирки, содержащие 1,8 миллилитров 0,01% Tween 20.

С помощью гемоцитометра подсчитайте каждую аликвоту дважды. Чтобы количественно определить афлатоксин, добавьте ядра из одного образца в чашку блендера объемом 50 миллилитров с 20 миллилитрами 80% метанола и 0,05 грамма хлорида натрия. Накройте крышкой и взбивайте на высокой скорости в течение одной минуты.

Поместите жидкую фильтровальную бумагу над чистым емкостью для сбора и вылейте экстракт в фильтр. Перелейте 10 миллилитров фильтрата в чистую емкость. Добавьте 20 миллилитров дистиллированной воды и хорошо перемешайте.

Отфильтруйте образец через стеклянный фильтр из микрофибры толщиной 1,5 микрона в чистую чашку. Нанесите один миллилитр отфильтрованного экстракта на тестовую колонку ALE и с помощью сжатого воздуха протолкните отфильтрованный экстракт через колонку со скоростью одна-две капли в секунду. Дважды промойте колонку одним миллилитром дистиллированной воды, пропуская ее через колонку со скоростью одна-две капли в секунду, пока не пройдет воздух.

Разбавьте колонку одним миллилитром 100% метанола класса ВЭЖХ со скоростью одна-две капли в секунду, собранным в Glass Q Vet. Добавьте один миллилитр проявителя для теста эля в EIT и хорошо перемешайте. Поместите Q VET в калиброванный флуориметр и считайте через 60 секунд Для анализа ацина B один или FB один анализ добавьте 10 миллилитров пробного раствора ацетонида 50 50 в воде в каждый образец биопроб ядра и извлекайте в течение ночи при комнатной температуре без перемешивания.

Смешайте экстракт с шестью миллилитрами деионизированной воды и нанесите его на столбец твердой фазы C 18, который был предварительно подготовлен двумя миллилитрами ацетилнитрила, а затем двумя миллилитрами воды. После загрузки образца промыть колонку двумя миллилитрами воды, а затем двумя миллилитрами ацетилнитрила в воде. Разбавьте образец FB, содержащий для анализа ВЭЖХ, двумя миллилитрами ацетилнитрила в воде.

Дериватизируйте ФБ, переложив один миллилитр колонки ЭИТ во флакон, содержащий 0,1 миллилитра боратного буфера и 0,1 миллилитра альдегида и инкубируйте в течение 10 минут. Остановите реакцию, добавив 0,5 миллилитра ацетилнитрила и 0,01 моляра раствора борной кислоты. Анализ FB one с помощью ВЭЖХ с использованием линейного градиента ацетилнитрила 0,1 молярного фосфата натрия.

Сравните образцы с FB одной стандартной кривой для анализа стероловой культуры, грибка на кукурузе от 7 до 14 дней. По истечении инкубационного периода добавьте в каждый флакон по 10 миллилитров хлороформаметанола. Хорошо встряхните образцы, а затем инкубируйте флаконы в темноте при комнатной температуре в течение 24 часов.

Центрифугируйте образцы при 5 000 об/мин в течение трех минут. Затем отфильтруйте надосадочную жидкость через нейлоновую мембрану толщиной 0,45 микрона. Введите образец непосредственно в колонку HBLC и выведите 100% метанол со скоростью потока 1,5 миллилитров в минуту.

Количественное определение образцов путем сравнения пиковых площадей со стандартной кривой, полученной из ВЭЖХ или гула. После инокуляции и инкубации в камере влажности в течение двух-трех суток. Грибковый рост должен начать появляться на зернах, как показано здесь.

Семидесятый вегетативный рост после обработки на инокулированных зернах должен быть хорошо виден, в то время как фиктивные контрольные ядра должны быть неинфицированными, периоды более длительной инкубации способствуют более обильному вегетативному росту. На этом рисунке показано, что флавус дикого типа NR RL 3 3 5 7 продемонстрировал максимальные значения колонизации, афлатоксина, накопления и продукции кедии в течение четырех, шести и восьми дней соответственно. Однако, когда контаминацию микотоксинов и тион сравнивали на единицу рола, наибольшие уровни наблюдались через четыре и шесть дней соответственно.

Здесь представлен представитель фумонизина и рола из хроматограммы ВЭЖХ с использованием методов, продемонстрированных в этом видео. Уровни фумонизина колеблются от 3 500 до 8 000 нанограмм на грамм ядра, а уровни ролла варьируются от 5 000 до 10 000 нанограммов на грамм ядра. После того, как биотесты ядер будут завершены, микотоксины и биомасса грибов могут быть измерены в течение двух-четырех дней, в зависимости от количества экспериментальных образцов.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости проводить методы в как можно более стерильной области после этой процедуры. Другие методы, такие как фито, гармоника, липидомика и протеомика, транскриптомика или другие межатомные методы, могут быть применены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие гены, белки и гормональные пути участвуют в этом важном взаимодействии.