Метод выделения и идентификации мРНК, микроРНК и белковых компонентов рибонуклеопротеидных комплексы из клеточных экстрактов использованием RIP-Chip

Целью данного видео является демонстрация метода выделения и идентификации РНК и белковых компонентов рибонуклеопротеиновых комплексов из клеточных экстрактов с использованием методов иммунопреципитации. Здравствуйте, меня зовут Гарретт Дом, я аспирант кафедры молекулярной микробиологии и иммунологии Миссурийского университета, обучающийся под руководством доктора Элиссо. Благодаря развитию высокопроизводительного секвенирования и эффективного анализа на микрочипах, глобальный анализ экспрессии генов стал простым и доступным способом сбора данных во многих исследовательских моделях и моделях заболеваний.

Однако стационарный уровень мРНК целевого гена не всегда напрямую коррелирует со стационарным уровнем белка. Вероятным объяснением этого расхождения является посттранскрипционная регуляция генов, обусловленная взаимодействием РНК-связывающих белков.

Посттранскрипционная регуляция влияет на локализацию, стабильность и трансляцию мРНК путем формирования рибонуклеопротеинового комплекса с целевыми мРНК. Идентификация этих неизвестных мишеней мРНК de novo в клеточных экстрактах в составе данного комплекса имеет решающее значение для понимания механизмов и функций РНК-связывающих белков и их итогового влияния на выход белка. В данном протоколе описывается метод, называемый иммунопреципитацией рибонуклеопротеинов (RIP), который позволяет идентифицировать специфические мРНК, ассоциированные с рибонуклеопротеиновым комплексом.

Перед началом эксперимента крайне важно подготовить все реактивы, контейнеры и инструменты. Обработайте стеклянную посуду ингибитором РНказ, например, RNA ZAP от Ambion, после чего промойте её водой, обработанной DEPC; убедитесь, что все используемые реактивы сертифицированы как свободные от РНказ. Первым этапом процедуры является выделение рибонуклеопротеинового комплекса из клеточного лизата: соберите клетки тканей, находящиеся в фазе экспоненциального роста, чтобы получить от 2 до 5 мг общего белка для каждого образца; обычно достаточно двух культуральных чашек P150.

В данном случае мы проводим сбор линий клеток рака молочной железы человека MB 2 31 и MC seven и исследуем рибонуклеиновые взаимодействия РНК-связывающего белка. Важно отметить, что для каждого исследуемого РНК-связывающего белка необходимо оптимизировать общее количество клеток и белков для максимизации соответствующих взаимодействий между целевой mRNA и РНК-связывающим белком. Осадите клетки путем центрифугирования при 1000 RPM в течение примерно 8–10 минут при 4 °C, затем трижды промойте ледяным PBS. После окончательной промывки аккуратно постучите по дну пробирки и ресуспендируйте осадок клеток в равных объемах подготовленного лизирующего буфера для полисом, содержащего ингибиторы РНКаз и протеаз.

Рекомендуется точно отмерить объем осадка клеток, осторожно перемешать смесь с помощью пипетирования для разрушения клеточных агрегатов и инкубировать лизат на льду в течение пяти минут. Центрифугируйте при 13,000 G в течение 20 минут при температуре four degrees Celsius, чтобы очистить лизат от клеточного дебриса; немедленно перенесите очищенный супернатант в предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки для РНК, держите их на льду и храните при температуре minus 80 degrees Celsius.

Данный лизат можно хранить до шести месяцев при температуре -80 °C. Избегайте повторных циклов замораживания и оттаивания, так как это может привести к деградации белков и/или мРНК. Рекомендуется проводить иммунопреципитацию (IP) незамедлительно.

Проведите экспресс-количественное определение концентрации белка в лизате с помощью стандартного метода Брэдфорд. Далее необходимо подготовить материалы для выделения конкретного интересующего нас белка. Сначала проведите предварительное набухание белка.

Бусины Sphero выдерживают в течение ночи в буфере NT two с добавлением 5% BSA при температуре 4 °C. Используйте буфер NT two с бусинами PAS в соотношении 4:1. Возможно длительное хранение при температуре 4 °C в течение нескольких месяцев.

При добавлении 0.1% sodium azi перед использованием удалите излишки буфера NT two таким образом, чтобы итоговое соотношение бусин к буферу составляло один к одному. Используя РНКаз-свободные микроцентрифужные пробирки объемом 1.5 milliliter, отберите 100 microliters суспензии SRO speed и добавьте 30 micrograms антител для каждой отдельной реакции IP. Например, в нашем эксперименте мы используем антитела who are, которые представляют собой антитела mouse IgG one.

Таким образом, в качестве контрольного антитела мы также используем IgG. Далее добавьте от 100 до 200 µL буфера NT two к смеси антител и магнитных частиц. Кроме того, в качестве контроля антител для учета фоновой РНК параллельно следует использовать антитела того же изотипа или цельную нормальную сыворотку того же вида.

Добавьте соответствующее антитело в смесь микросфер и инкубируйте в течение ночи в режиме вращения end-over-end при температуре four degrees Celsius. Перед использованием подготовьте микросферы, покрытые антителами, промыв их один миллилитр ледяного буфера NT two пять раз; промывайте микросферы путем центрифугирования при 13, 000 G в течение одной-двух минут при температуре four degrees. Осторожно удалите супернатант с помощью ручного дозатора или аспиратора.

Данная промывка способствует удалению несвязавшихся антител, а также загрязнений РНК из смеси антител. После завершения финальной промывки ресуспендируйте гранулы в 700 µL ледяного буфера NT2, затем обработайте смесь различными ингибиторами РНКаз для защиты целевых мРНК, добавив 10 µL RNaseOUT, 10 µL 100 mM DTT и 15 µL EDTA. Доведите объем до 900 µL с помощью буфера NT2.

Затем мы проведем иммунопреципитацию целевого комплекса. Для снижения фонового сигнала при анализе РНК после процедуры RIP мы настоятельно рекомендуем выполнить этап предварительной очистки: проведите преклиринг с использованием 15 µg изотипического контроля в течение 30 минут при 4 °C. Добавьте 50 µL предварительно набухших PAS-бисеров, не покрытых антителами.

Инкубируйте в течение 30 минут при 4 °C при постоянном перемешивании, затем центрифугируйте при 10 000 G и 4 °C. Осадите образец. Сохраните супернатант для иммунопреципитации.

Затем добавьте 100 µL очищенного лизата с содержанием белка приблизительно от двух до пяти мг в подготовленную смесь антител. Разведение лизата поможет снизить фоновый сигнал; плотно закройте пробирку с помощью парафильма и инкубируйте при 4 °C в течение четырех часов в режиме вращения. Затем осадите гранулы при 5 000 ×g в течение пяти минут при 4 °C и сохраните супернатант для возможного анализа, поместив его на хранение при -80 °C, как было описано ранее. Пять раз промойте гранулы 1 мл ледяного буфера TNT и центрифугируйте.

Затем удалите супернатант с помощью ручной пипетки или аспиратора. Для снижения фонового сигнала могут быть использованы более жесткие методы, такие как добавление дезоксихолата натрия, мочевины или SDS в буфер NT2. По возможности держите образцы на льду и работайте быстро, чтобы минимизировать деградацию целевой мРНК.

Наконец, для выделения РНК рибонуклеопротеинов мы проведем обработку ДНКазами и протеиназой K с последующим осаждением РНК. После промывки суспендируйте гранулы в 100 µL буфера N NT two, дополненного 5 µL безРНК-ДНКазы 1. Выдержите образцы при 37 °C в течение 5–10 минут. Добавьте 1 мл буфера N NT two и центрифугируйте при 5,000 ×g в течение пяти минут.

Удалите супернатант после центрифугирования, resuspended pellet SROs в 100 µL буфера NT2, содержащего 5 µL протеиназы K в концентрации 10 mg/mL и 1 µL 10% SDS. Инкубируйте суспензию бусин в течение 30 минут на водяной бане при 55 °C, аккуратно встряхивая пробирку каждые 10 минут. Протеиназа K способствует высвобождению рибонуклеопротеиновых компонентов. Осадите бусины путем центрифугирования.

Центрифугируйте при 5,000 G в течение пяти минут при комнатной температуре, затем соберите супернатант, объем которого должен составлять примерно 100 microliters. Затем к гранулам добавьте 200 microliters буфера NT two и центрифугируйте при 5,000 G в течение двух минут. Соберите примерно 200 microliters супернатанта, а гранулы удалите.

Объедините супернатант, добавьте 300 µL кислотного фенола для нижнего слоя и перемешайте на вортексе. Выдержите одну минуту при комнатной температуре и центрифугируйте с максимальной скоростью при комнатной температуре в течение одной минуты. Соберите 250 µL верхнего слоя.

Будьте очень осторожны, чтобы не нарушить поверхность раздела фаз, так как это приведет к контаминации. К образцу РНК добавьте 25 µL ацетата натрия при pH 5.2, 625 µL охлажденного 100% этанола и 5 µL смеси GlycoBlue. Хорошо перемешайте и храните в течение ночи при -20 °C.

Кроме того, для обеспечения надлежащего извлечения РНК добавляют GlycoBlue; он служит молекулой-носителем, что повышает видимость осадка РНК на следующий день. Перемешайте содержимое пробирок, перевернув их три-пять раз, затем центрифугируйте при 12 000 G и температуре 4 °C в течение 30 минут и удалите супернатант. Добавьте 1 мл охлажденного 70% этанола к голубому осадку и перемешайте путем инверсии или вортексирования, после чего центрифугируйте.

Центрифугируйте образец при 12, 000 G в течение двух минут при температуре четыре градуса Цельсия. Удалите супернатант и снова центрифугируйте при 12, 000 G в течение одной минуты при температуре четыре градуса Цельсия. Удалите остатки 70% этанола с помощью пипетки и высушите осадок на воздухе.

Выдержите при комнатной температуре в течение пяти минут. Ресуспендируйте в 20–40 µL воды, свободной от РНКаз и ДНК. Теперь образец готов к количественному определению с помощью спектрометрии NanoDrop и дальнейшему использованию, например, для количественной ПЦР в реальном времени или микрочипового анализа. После выделения РНК были проведены микрочиповый анализ и количественная ПЦР в реальном времени для выявления мРНК-мишеней РНК-связывающего белка who are, а также для определения степени их обогащения в результате иммунопреципитации.

Подтверждение с помощью вестерн-блоттинга свидетельствует о чистой изоляции белков. Количественная ПЦР демонстрирует кратность обогащения мРНК-мишени бета-актина по сравнению с контролем IgG. В то время как микрочиповый анализ выявляет уникальные генетические профили линий клеток рака молочной железы MC seven и MB 2 31, иммунопреципитация рибонуклеопротеинов была установлена нашей группой, а также многими другими исследовательскими группами, в качестве отличного инструмента для изоляции и изучения взаимодействий между РНК-связывающими белками и их мРНК-мишенями; несмотря на высокую чувствительность метода, правильное выполнение данной процедуры позволит изолировать эти рибонуклеопротеиновые комплексы, которые до недавнего времени были недоступны для обнаружения и анализа.