Метод выделения и идентификации мРНК, микроРНК и белковых компонентов рибонуклеопротеидных комплексы из клеточных экстрактов использованием RIP-Chip

Цель данного видео – продемонстрировать метод выделения и идентификации РНК и белковых компонентов рибонуклеопротеиновых комплексов из клеточных экстрактов с помощью методов иммунопреципитации. Здравствуйте, меня зовут Гаррет Дом, и я аспирант факультета молекулярной и микробиологии и иммунологии в Университете Миссури, обучаюсь у доктора Эли Ссо. Благодаря достижениям в области высокопроизводительного секвенирования и эффективного анализа микрочипов, глобальная экспрессия и анализ генов стали простой и легкодоступной формой сбора данных во многих исследованиях и моделях заболеваний.

Тем не менее, уровни мРНК гена-мишени в исследуемом состоянии не всегда напрямую коррелируют с уровнями белка в стационарном состоянии. Посттранскрипционная регуляция генов является вероятным объяснением расхождения между ними. Обусловлен взаимодействием РНК-связывающих белков.

Посттранскрипционная регуляция влияет на локализацию, стабильность и трансляцию мРНК путем формирования комплекса белка ядра ребра с мишенями-мРНК. Идентификация этих неизвестных мишеней мРНК Denovo из клеточных экстрактов в этом комплексе имеет решающее значение для понимания механизмов и функций РНК-связывающего белка и их результирующего влияния на выход белка. В этом протоколе описывается метод, называемый рибопротеином, иммунопреципитацией или RIP, который позволяет идентифицировать специфические мРНК, ассоциированные в рибонуклеопротеиновом комплексе.

Перед началом эксперимента очень важно иметь при себе все реактивы, емкости и посуду. Не содержащие РНК обрабатывают стеклянную посуду ингибитором Rnase, таким как РНК ZAP из амбиона, с последующим промыванием водой, обработанной dpci, гарантируют, что все реагенты не содержат РНК. Первым этапом процедуры является сбор комплекса белков ядра ребер из клеточного лизата, собирающего экспоненциально растущие клетки ткани для производства от двух до пяти миллиграммов общего белка для каждого используемого образца, обычно достаточно двух культуральных чашек P one 50.

Здесь мы собираем MB 2, 31 и MC семь клеточных линий рака молочной железы человека и исследуем взаимодействия ядра рибонов белка, связывающего РНК. Важно отметить, что для каждого исследуемого РНК-связывающего белка общее количество клеток и количество белка должны быть оптимизированы для максимизации соответствующих взаимодействий мишеней мРНК и РНК-связывающих белков. Гранулированные клетки с помощью центрифугирования при 1000 об/мин в течение примерно восьми-10 минут при четырех градусах Цельсия, затем трижды промыть ледяным PBS После заключительной промывки аккуратно переверните дно пробирки и ресуспендируйте клеточные гранулы в равных объемах приготовленного полисомального лизисного буфера с РНК и ингибиторами протеазы.

Рекомендуется отмерить точный объем клеточной гранулы, аккуратно пипеткой смеси разбить комки клеток и инкубировать лизат на льду в течение пяти минут. Центрифугируйте при 13 000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы очистить лизат от мусора и немедленно перенести очищенную надосадочную жидкость на предварительно охлажденные РНК. Бесплатные микроцентрифужные пробирки держатся на льду и хранятся при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Этот лизат может храниться до полугода при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Избегайте повторных циклов замораживания и размораживания, так как это может привести к деградации белка и/или мРНК. Лучше всего сделать ИП сразу.

Быстро определите концентрацию белка и лизата с помощью стандартного анализа белка по Брэдфорду. Далее нам нужно будет подготовить материалы для выделения интересующего нас специфического белка. Сначала предварительно набухаем белок.

Бусины Sphero на ночь в N NT два буфера с добавлением 5% BSA сохраняют при четырех градусах Цельсия. Используйте два буфера NT в соотношении четыре к одному с шариками PAS. Возможно длительное хранение до нескольких месяцев при четырех градусах Цельсия.

После добавления 0,1% ази натрия перед использованием удалите излишки NT two buffer, чтобы окончательное соотношение гранул к буферу было один к одному. Используя микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра, не содержащие РНК, удалите 100 микролитров скоростной суспензии SRO и добавьте 30 микрограммов антител для каждой отдельной реакции IP. Например, в нашем эксперименте мы используем антитело who, которое является антителом IgG к одной мыши.

Поэтому наше контрольное антитело также является антителом IgG. Затем добавьте от 100 до 200 микролитров NT two буфера в смесь гранул антител. Кроме того, совместимое с изотипом антитело или целая нормальная сыворотка из того же вида должны использоваться параллельно в качестве контроля антител против фоновой РНК.

Добавьте соответствующие антитела в смесь шариков и инкубируйте в течение ночи, кувыркаясь при температуре четыре градуса Цельсия. Подготовьте покрытые антителами шарики непосредственно перед использованием путем промывки одним миллилитром ледяного NT двумя буферами пять раз промыть шарики центрифугированием при 13 000 G в течение одной-двух минут при четырех градусах. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью ручной пипетки или аспиратора.

Эта промывка помогает удалить несвязанные антитела, а также РНК из смеси антител. После того, как окончательная промывка будет завершена, реаверсионный раствор суспендирует гранулы и 700 микролитров ледяного буфера Т-2, после чего следует обработка различными ингибиторами РНК для защиты целевых мРНК, включая 10 микролитров РНК, 10 микролитров 100 миллимолярных ДТТ и 15 микролитров ЭДТА. Доведите объем до 900 микролитров с помощью NT двух буферов.

Далее мы проведем иммуноосаждение целевого комплекса. Мы настоятельно рекомендуем использовать этап предварительного клира для снижения фонового сигнала в анализе РНК после процедуры рипа с помощью 15 микрограммов контроля изотипа в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Добавьте 50 микролитров набухших шариков PAS, не покрытых антителами.

Инкубировать 30 минут при четырех градусах Цельсия при вращении и более в центрифуге при 10 000 G при четырех градусах Цельсия. Две дробины. Приберегите супер натин для ип.

Затем добавьте 100 микролитров изолированного очищенного лизата с примерно двумя-пятью миллиграммами белка в приготовленную смесь антител. Разбавление лизата поможет уменьшить фон обмотки трубки и параформы для обеспечения плотного потолка и инкубации при четырех градусах Цельсия в течение четырех часов, кувыркаясь и более в следующих гранулах, шарики при 5000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и сохраните супернат для потенциального анализа, храня при температуре минус 80 градусов Цельсия, как описано ранее. Промойте бусины пять раз одним миллилитром ледяного льда и Т двумя буферами и центрифугированием.

Затем удалите супер натин с помощью ручного пипеттера или аспиратора. Более строгие методы могут быть использованы для снижения фона путем добавления NT 2 буфера с покрытием дезокси натрия, uria или SDS. Держите образцы на льду как можно дольше и работайте быстро, чтобы свести к минимуму деградацию целевой мРНК.

Наконец, мы будем использовать обработку ДНК и протеиназой К с последующим осаждением РНК для выделения РНК ядерного белка рибон после промывки ресуспензионных гранул 100 микролитров N NT два буфера, дополненных пятью микролитрами свободных РНК и одним из них. Держите образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти-10 минут. Добавьте один миллилитр N NT в два буфера и крутите при 5 000 G в течение пяти минут.

Выбросьте SUPERNAT Reese spin protein a SRO pellet и 100 микролитров NT два буфера с пятью микролитрами протеиназы K в концентрации 10 мг на миллилитр и одним микролитром 10% SDS, инкубируйте ресуспендированную смесь гранул в течение 30 минут на водяной бане при температуре 55 градусов Цельсия, осторожно взбивая каждые 10 минут. Протеиназа К будет способствовать высвобождению компонентов белка ядра ребра. Шарики для гранул

Добавьте 5 000 г в течение пяти минут при комнатной температуре, соберите супер название, которое должно быть примерно 100 микролитров по объему. Далее две бусины, добавьте 200 микролитров NT в двух буферных центрифугах при 5 000 г в течение двух минут. Соберите примерно 200 микролитров супер натина и выбросьте бусины.

Соедините супер натин и добавьте 300 микролитров нижнего слоя кислотного фенольного вихря. Одна минута при комнатной температуре и максимальная скорость центрифуги при комнатной температуре в течение одной минуты. Наберите 250 микролитров верхнего слоя.

Будьте очень осторожны, чтобы не потревожить интерфейс, так как это приведет к загрязнению. В образец РНК добавляют 25 микролитров ацетата натрия при рН 5,2, 625 микролитров охлажденного, 100% этанола и пять микролитров смеси гликосины. Хорошо хранить в течение ночи при температуре минус 20 градусов по Цельсию.

Дополнительно для обеспечения правильного восстановления РНК. Добавление гликосины увеличит видимость гранулы РНК, действуя как молекула-переносчик на следующий день, смешает пробирки, перевернув от трех до пяти раз, затем вращает при 12 000 G при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут и выбрасывает супернатин. Добавьте один миллилитр охлажденного, 70% этанола в синюю гранулу и перемешайте инверсией или вихревой центрифугой.

Образец при температуре 12 000 G при четырех градусах Цельсия в течение двух минут. Выбросьте супернат и центрифугируйте при 12 000 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия. Удалите остатки 70% этанола с помощью пипетки и высушите гранулы на воздухе.

Добавьте комнатную температуру на пять минут. Повторно расходуйте от 20 до 40 микролитров РНК, воды, свободной от ДНК. В настоящее время образец готов к количественному определению с помощью спектрометрии NanoDrop и дальнейшим последующим приложениям, таким как количественная ПЦР в реальном времени или анализ микрочипов после выделения РНК, микрочип и количественная ПЦР в реальном времени для выявления мишеней мРНК-связывающего белка, которые являются таковыми, и их последующего обогащения за счет иммунопреципитации.

Подтверждение вестерн-блоттингом показывает четкую изоляцию того, кто является белком. Количественная ПЦР демонстрирует кратное обогащение мишени мРНК бета-актина по сравнению с контрольной группой IgG. В то время как анализ микрочипов выявляет уникальные генетические профили между MC 7 и MB 2 31, общая иммунопреципитация клеток рака молочной железы является отличным инструментом, используемым для выделения и изучения взаимодействий между РНК-связывающими белками и их MR. Мишени нашей группы, а также многих других исследовательских групп, хотя и чувствительные по своей природе и практике, при правильном выполнении этой процедуры приведет к выделению этих реберных нуклеобелковых комплексов, которые до недавнего времени были недоступны для открытия и анализа.