Хроматина Изоляция очистки РНК (чирпа)

Общая цель следующего эксперимента заключается в определении участков ДНК, которые связаны со специфической некодирующей РНК, с использованием QPCR или высокопроизводительного секвенирования. Это достигается путем кросс-линкинга клеток для фиксации нативных взаимодействий ДНК-РНК in vivo. На втором этапе клетки лизируют и подвергают соникации для солюбилизации клеточного лизата и фрагментации хроматина на короткие участки.

Затем к лизату клеток добавляют биотинилированные антисмысловые олигонуклеотиды для специфического обогащения интересующих комплексов РНК-ДНК; полученные результаты позволяют определить идентичность геномных сайтов связывания некодирующих РНК с помощью количественной ПЦР или высокопроизводительного секвенирования. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как FISH РНК-ДНК, является то, что метод CHIRP позволяет создавать полногеномные карты сайтов связывания некодирующих РНК с разрешением почти до одного нуклеотида. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области некодирующих РНК, например, о том, как lncRNA и другие РНК обеспечивают дозовую компенсацию у самцов мух.

Значение данного метода заключается в возможности разработки терапии заболеваний, связанных с некодирующими РНК, поскольку он позволяет лучше понять, как некодирующие РНК регулируют состояние хроматина и экспрессию генов. Для проведения данного эксперимента по выделению хроматина путем очистки РНК или метода ChIRP после центрифугирования собирают 40 миллионов клеток, сливают PBS и удаляют оставшуюся жидкость, осторожно аспирируя ее под углом; затем осадок клеток отделяют, постукивая по дну пробирки Falcon. Добавляют свежеприготовленный 1% раствор глутарового альдегида, начиная с небольшого объема, и ресуспендируют клеточный осадок, доводя объем до полного, после чего перемешивают путем переворачивания; проводят сшивку в течение 10 минут при комнатной температуре на игольчатом или роторном шейкере. Реакцию сшивки останавливают, добавив 1/10 объема 1,25 М глицина, и выдерживают на шейкере при комнатной температуре в течение пяти минут, при этом клетки приобретут ярко-оранжевый цвет.

Затем центрифугируйте при 2000 RCF в течение пяти минут, слейте и аспирируйте супернатант, после чего промойте осадок 20 миллилитрами охлажденного PBS. Снова центрифугируйте, аспирируйте супернатант и ресуспендируйте промытый сшитый осадок в охлажденном PBS. Перенесите по одному миллилитру клеток в пробирки типа Эппендорф и центрифугируйте при 2000 RCF в течение трех минут при четырех градусах celsius. После центрифугирования с помощью наконечника пипетки осторожно удалите как можно больше PBS.

Мгновенно заморозьте все осадки клеток в жидком азоте и храните при температуре минус 80 °C неограниченное время. Для подготовки клеточного лизата для CHIRP разморозьте замороженные сшитые осадки клеток при комнатной температуре. Сильно постучите по пробирке, чтобы отделить и перемешать осадок клеток.

Центрифугируйте осадки и с помощью острого наконечника дозатора на 10 µL удалите остатки PBS, используя электронные весы с точностью до 1 мг. Взвесьте пустую пробирку типа «eppendorf». Взвесьте каждый осадок и запишите его массу.

Добавьте в каждую пробирку 10 объемов буфера для лизиса, дополненного свежеприготовленным ингибитором протеаз PMSF и super ace, и ресуспендируйте осадок. Лизат клеток должен быть использован сразу после приготовления. Перенесите не более 1,5 мл лизата в каждую пробирку Falcon объемом 15 мл и плотно закрутите зонды для соникации.

Затем поместите пробирки в ультразвуковой гомогенизатор и проведите соникацию при температуре 4 °C на максимальной мощности с импульсными интервалами 30 секунд работы и 45 секунд отдыха. Проверяйте лизат каждые 30 минут. Продолжайте соникацию до тех пор, пока клеточный лизат не перестанет быть мутным.

Это может занять от 30 минут до четырех часов в зависимости от количества пробирок, объема образца, температуры ванны и времени ультразвуковой обработки. Когда лизат станет прозрачным, перенесите 5 µL в новую пробирку типа «эппендорф». Добавьте буфер для протеазы K ДНК и протеазу K, перемешайте на вортексе и кратковременно центрифугируйте; инкубируйте в течение 45 минут при 50 °C, после чего экстрагируйте ДНК с помощью набора для очистки ПЦР.

Проверьте размер ДНК на 1% агарозном геле. Основная часть шлейфа ДНК должна находиться в диапазоне от 100 до 500 пар оснований, что указывает на полную соникацию. Центрифугируйте аликвоты соникатов объемом один миллилитр при 16 100 RCF в течение 10 минут при температуре четырех градусов Цельсия, перенесите супернатант в чистые пробирки Эппендорфа и подвергните быстрому замораживанию в жидком азоте перед началом процедуры ChIRP. Разморозьте пробирки с хроматином при комнатной температуре для типичного образца ChIRP.

Из одного миллилитра лизата отберите 10 мкл для анализа РНК и 10 мкл для анализа ДНК, поместив их в микроцентрифужные пробирки типа «эппендорф». Храните на льду до дальнейшего использования. Перенесите один миллилитр каждого образца хроматина в пробирку типа «Фалкон» объемом 15 мл.

Добавьте два миллилитра гибридизационного буфера в каждую пробирку. Затем разморозьте зонды при комнатной температуре. Эти биотинилированные тайлинговые олигонуклеотиды помечены в соответствии с их положением в РНК и разделены на два пула.

Четный пул содержит все зонды с четными номерами, а нечетный пул — зонды с нечетными номерами. Все эксперименты проводятся с использованием обоих пулов, которые служат внутренним контролем друг для друга.

Одним из наиболее сложных аспектов данного протокола является необходимость проведения всех этапов гибридизации и промывки при температуре 37 °C. Чтобы обеспечить стабильную температуру эксперимента, выполняйте все действия в термостате или рядом с ним. Добавьте соответствующий объем зондов в определенные пробирки. Тщательно перемешайте и инкубируйте при 37 °C в течение четырех часов с перемешиванием, прекратив его за 20 минут до завершения гибридизации.

Подготовьте магнитные бусины C one. Используйте 100 µL на 100 pm probes. Промойте бусины буфером для лизиса без добавок объемом 1 мл трижды, используя магнитную стойку Dyna mag two для отделения бусин от буфера.

После финальной промывки ресуспендируйте гранулы в исходном объеме лизирующего буфера и добавьте свежеприготовленный PMSF и ингибитор протеаз. По завершении четырехчасовой реакции гибридизации добавьте по 100 µL гранул в каждую пробирку, перемешайте. Инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут при встряхивании, затем промойте гранулы 1 мл промывочного буфера, предварительно нагретого до 37 °C (для первой промывки).

Используйте магнитную планку DynaMag 15 для отделения гранул, слейте супернатант и ресуспендируйте осадок в 1 mL промывочного буфера, затем перенесите в пробирку EOR объемом 1,5 mL. Инкубируйте при 37 °C с перемешиванием в течение пяти минут; при последующих промывках центрифугируйте каждую пробирку в мини-центрифуге, поместите образец на магнитную планку DynaMag 2 на одну минуту и слейте супернатант. Удалите капли с помощью салфетки Kimwipe и ресуспендируйте в 1 mL.

Промойте буфером для промывки, инкубируйте при 37 °C при перемешивании в течение пяти минут. Повторите процедуру до пяти промывок. После последней промывки тщательно ресуспендируйте гранулы, отберите 100 µL и отложите для выделения РНК, оставшиеся 900 µL зарезервируйте для фракции ДНК.

Поместите все пробирки на магнитную полосу dyna mag и удалите промывочный буфер. После кратковременного центрифугирования снова поместите пробирку на магнитную полосу, используя острый наконечник дозатора объемом 10 µL. Полностью удалите остатки промывочного буфера из каждой пробирки.

Затем из образцов chirp выделяют фракции РНК и ДНК для количественного анализа и секвенирования. На данном рисунке показано обогащение человеческой теломеразы, РНК или Turk из клеток HELOC по сравнению с GA dh — распространенной клеточной РНК, которая служит отрицательным контролем.

Большая часть РНК Turk, присутствующей в клетке, около 88%, была осаждена с помощью метода CHIRP, в то время как было извлечено лишь 0,46% РНК GAPDH, что демонстрирует коэффициент обогащения примерно в 200 раз. Неспецифические зонды, такие как зонды, нацеленные на РНК LAC Z, которая обычно не экспрессируется в клетках млекопитающих, могут быть использованы в качестве дополнительных отрицательных контролей. Участки ДНК, которые, как ожидается, связываются с мишенью. При измерении методом количественной ПЦР длинные некодирующие РНК обычно обогащены по сравнению с отрицательными участками.

На этом рисунке представлена валидация методом QPCR четырех участков связывания hot air в первичных фибробластах крайней плоти человека, определенных путем проведения chirp SSE в той же клеточной линии, в то время как участки ДНК Turk и GA DH служат регионами отрицательного контроля. Как четные, так и нечетные наборы зондов обеспечили сопоставимое обогащение ожидаемых участков связывания hot air по сравнению с отрицательными регионами. Это является характерным признаком истинных сайтов связывания длинных некодирующих РНК.

Глобальную карту сайтов связывания длинных некодирующих РНК можно получить с помощью высокопроизводительного секвенирования ДНК, обогащенной методом CHIRP, что проиллюстрировано данными для длинной некодирующей РНК roX2, которая, как известно, взаимодействует с X-хромосомой таким образом, который необходим для дозовой компенсации. Образцы из четных и нечетных повторностей секвенировались отдельно, а их уникальный шум был устранен для создания трека перекрывающихся сигналов, где каждый пик указывает на сильный сайт связывания roX2. При выполнении этой процедуры важно применять правильную технику работы с РНК-free материалами. После завершения данной процедуры.

Для ответа на дополнительные вопросы, например, о том, какие белки взаимодействуют с интересующей неклинической DRNA после ее разработки, могут быть использованы другие методы, такие как вестерн-блоттинг. Метод CHI открыл исследователям в области биологии РНК возможность картирования РН в культурах клеток и фиксированных тканях.