Хроматина Изоляция очистки РНК (чирпа)

Общая цель данного эксперимента заключается в определении участков ДНК, которые связаны со специфической некодирующей РНК с помощью QPCR или высокопроизводительного секвенирования. Это достигается за счет сшивки клеток для улавливания нативных взаимодействий D-N-A-R-N-A IN VIVO. На втором этапе клетки лизируются и подвергаются ультразвуковой обработке для солюбилизации клеточного лизата и чистого хроматина на мелкие фрагменты.

Затем к лизату клетки добавляют биотинилированные антисмысловые олигонотиды для того, чтобы специфически обогатить комплексы R-N-A-D-N-A, представляющие интерес, и выясняют идентичность некодирующих РНК-связанных геномных сайтов на основе QPCR или высокопроизводительного секвенирования. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как R-N-A-D-N-A FISH, заключается в том, что CHIRP позволяет составить полногеномные карты некодирующих сайтов связывания РНК с разрешением, близким к паре оснований. Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы в области некодирующих РНК, например, как камни, РНК и самцы мух достигают компенсации дозы.

Значение этого метода, степень его применения в терапии некодирующих заболеваний, связанных с НК, поскольку позволяет лучше понять, как некодирующие РНК регулируют состояния хроматина и экспрессию генов. Для этого выделения хроматина с помощью очистки РНК или эксперимента с чирпированием 40 миллионов клеток будут собраны после центрифугирования, сцежены PBS и удалена оставшаяся жидкость путем осторожной аспирации под углом, вытесненным из клеточной гранулы, постукивающим по дну соколиной трубки. Добавить свежеприготовленный 1%-ный глутаральдегид, начиная с небольшого объема и повторно суспендировать клеточную гранулу долей до полного объема, а затем перевернуть для перемешивания в течение 10 минут при комнатной температуре на встык-шейкер или ротатор погасить реакцию сшивания одним 10-м объемом 1,25 молярного глицина и оставить на шейкере при комнатной температуре на пять минут, Клетки станут ярко-оранжевыми.

Затем открутите при 2000 RCF в течение пяти минут, сцедите и аспирируйте надосадочную жидкость и промойте гранулу 20 миллилитрами охлажденного PBS, снова открутите, отсадите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте промытое сшитое небо охлажденным PBS. Перенесите каждый миллилитр клеток в эйнорскую трубку и вращайте при температуре 2000 RCF в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования с помощью наконечника для дозатора осторожно удалите как можно больше PBS.

Вспышкуйте, заморозьте все клеточные гранулы в жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия неопределенный срок. Чтобы приготовить лизат клеток для чирпирования, разморозьте замороженные гранулы сшитых клеток при комнатной температуре. Сильно постучите, чтобы выбить и перемешать клеточную гранулу.

Уменьшите количество гранул и с помощью острого наконечника пипетки объемом 10 микролитров удалите остатки PBS на электронных весах с точностью до одного миллиграмма. Разорвите массу пустой эйноровой трубки. Взвесьте каждую дробину и запишите ее вес.

Добавьте 10-кратный объем буфера для лизиса, дополненный свежим ингибитором протеазы PMSF, и добавьте супер ас в каждую пробирку и повторно суспендируйте гранулу. Лизат клеток необходимо обработать сразу после его приготовления. Перелейте не более 1,5 миллилитров лизата в каждую 15-миллилитровую соколиную трубку и вставьте ультразвуковые щупы, плотно прикрутив их.

Затем поместите трубки в биоразрыв, обрабатывайте ультразвуком при температуре четыре градуса Цельсия на самой высокой настройке в течение 30 секунд при 45-секундном интервале импульса. Проверяйте лизат каждые 30 минут. Продолжайте обработку ультразвуком до тех пор, пока лизат клеток не перестанет мутнеть.

Это может занять от 30 минут до четырех часов в зависимости от количества пробирок, объема образца, температуры ванны и времени ультразвуковой обработки. Когда лизат станет прозрачным, переложите пять микролитров в свежую эйноровую трубку. Добавьте протеазу ДНК, буфер K и вихрь протеазы K для смешивания и кратковременного вращения, инкубируйте в течение 45 минут при температуре 50 градусов Цельсия после извлечения ДНК с помощью набора для очистки ПЦР.

Проверьте размер ДНК на геле 1%aros. Основная масса мазка ДНК должна составлять от 100 до 500 пар оснований, что указывает на полную центрифугу с ультразвуком. Один миллилитр аликвот образцов, обработанных ультразвуком при 16, 100 RCF в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, перенести надосадочную жидкость в свежие эйноровые пробирки и мгновенно заморозить в жидком азоте, чтобы начать процедуру ЛЧМ-размораживания пробирок с хроматином при комнатной температуре для типичного ЛЧМ-образца.

Используя один миллилитр лизата, удалите 10 микролитров для ввода РНК и 10 микролитров для ввода ДНК и поместите в пробирки эйнора. Держите на льду до тех пор. Используйте пересадку по одному миллилитру каждого образца хроматина в пробирку сокола объемом 15 миллилитров.

Добавьте в каждую пробирку по два миллилитра буфера для гибридизации. Далее разморозьте щупы при комнатной температуре. Эти биотинилированные плиточные олигопласты помечены в соответствии с их положением вдоль РНК и разделены на два пула.

Четный пул содержит все зонды с четными номерами. А нечетный пул содержит зонды с нечетными номерами. Все эксперименты проводятся с использованием обоих пулов, которые служат для внутреннего контроля друг друга.

Одним из самых сложных аспектов настоящего протокола является то, что все этапы гибридизации и промывки должны выполняться при температуре 37 градусов. Чтобы обеспечить постоянную экспериментальную температуру, выполняйте все шаги в печи для проживания или рядом с ней, добавьте соответствующий объем зондов в определенные пробирки. Хорошо перемешать, инкубировать при 37 градусах в течение четырех часов с встряхиванием за 20 минут до завершения гибридизации.

Подготовьте магнитные бусины C one. Используйте 100 микролитров на 100 пикомоль щупов. Промойте с одним миллилитром и трижды дополните буфер для лизиса с помощью двухполосочного магнита Dyna mag, чтобы отделить шарики от буфера.

После окончательной промывки суспензируйте шарики в исходном объеме буфера для лизиса и дополните суперином свежим PMSF и ингибитором протеазы. Когда четырехчасовая реакция гибридизации будет завершена, добавьте по 100 микролитров гранул в каждую пробирочную смесь. Хорошо выдерживаем при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, встряхивая шарики с одним миллилитром буфера для стирки, предварительно подогрев до 37 градусов Цельсия на первой стирке.

С помощью магнитной полосы dyna mag 15 отделите шарики, сцедите и повторно суспендируйте в один миллилитр промывочного буфера, переложите в пробирку EOR объемом 1,5 миллилитров. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение пяти минут на последующих промывках, раскрутите каждую пробирку в мини-центрифуге и установите образец на динамометрическую магнитную полосу для одной минуты сцеживания образца. Протрите все капли салфеткой Кима и повторно суспендируйте в одном миллилитре.

Промойте буфер, выдержите при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение пяти минут. Повторите в общей сложности пять мывок при последней промывке Resus. Хорошо подвешиваем бусины, удаляем 100 микролитров и откладываем для выделения РНК резерв 900 микролитров для фракции ДНК.

Поместите все трубки на магнитную полосу dyna mag tube и снимите буфер для промывки. После короткого отжима снова поместите трубку на магнитную полоску с острым наконечником пипетки объемом 10 микролитров. Полностью удалите оставшийся буфер для промывки из каждой пробирки.

Фракции РНК и ДНК впоследствии выделяют из образцов ЛЧМ для количественного определения и секвенирования. На этом рисунке показано обогащение теломеразой человека, РНК или турком из клеток HELOC по сравнению с GA dh. Обильное количество клеточной РНК, которая служит в качестве отрицательного контроля.

Большая часть турецкой РНК, присутствующей в клетке, около 88%, была удалена путем выполнения чирпирования, в то время как только 0,46% GA DH РНК было получено, демонстрируя коэффициент обогащения примерно в 200 раз. Неспецифические зонды, такие как зонды, нацеленные на LAC ZRNA, который обычно не экспрессируется в клетках млекопитающих, могут быть использованы в качестве дополнительного негативного контроля. Ожидается, что участки ДНК связываются с мишенью. Длинные некодирующие РНК обычно обогащаются отрицательными областями при измерении с помощью QPCR.

На этом рисунке показана валидация методом QPCR четырех связанных с горячим воздухом сайтов в первичных фибробластах крайней плоти человека, определенных путем проведения ЧРП SSE в той же клеточной линии, в то время как сайты ДНК Turk и GA DH служат в качестве отрицательных контрольных областей. Как четные, так и нечетные наборы зондов дали сопоставимое обогащение ожидаемых участков, связанных горячим воздухом, над отрицательными областями. Отличительная черта истинно длинных некодирующих сайтов связывания РНК.

Глобальная карта длинных некодирующих сайтов связывания РНК может быть получена с помощью высокопроизводительного секвенирования ДНК, обогащенной чирп, как показано на этих данных длинной РНК Rocks two, которая, как известно, взаимодействует с Х-хромосомой таким образом, что это требуется для компенсации дозы. Как четные, так и нечетные сэмплы были секвенированы отдельно, и их уникальные шумы были устранены, чтобы создать трек перекрывающихся сигналов, где каждый пик указывает на сильное изображение горных пород, связанных двумя связанными при попытке этой процедуры. После этой процедуры важно использовать правильную технику без РНК.

Другие методы, такие как блоттинг белками, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие белки взаимодействуют с интересующей неклинической РНК после ее разработки. CHI проложила путь исследователям в области биологии РНК к картированию аакта РНК в культуральных клетках и фиксированных тканях.