Гидрофобные Солт-модифицированный Nafion для иммобилизации ферментов и стабилизации

Общая цель данной процедуры заключается в синтезе полимера для иммобилизации и стабилизации клеточных ферментов. Для этого сначала смешайте суспензию нафиона с солью бромида аммония и перемешайте смесь на вортексе, чтобы заменить протонированную форму нафиона солями аммония. На втором этапе полученный полимер высушивают, переливая смесь в чашку для выпаривания и давая растворителям испариться.

Затем выдержите полимер в деионизированной воде от 12 до 24 часов для удаления избытка соли. После экстракции соли промойте полимер водой, а затем дайте ему полностью высохнуть путем испарения. Заключительным этапом является перенос полимера в чистый флакон и его ресуспендирование в растворителе для использования при иммобилизации фермента. В конечном итоге этот разработанный нами полимер для иммобилизации ферментов применяется для повышения стабильности ферментов в анализах на активность.

Как правило, люди, впервые осваивающие этот метод, сталкиваются с трудностями, поскольку процедура кажется предельно простой, однако процесс сушки имеет решающее значение для создания функционального полимера. Демонстрацию данной процедуры проведет аспирант моей лаборатории. Чтобы начать процедуру модификации nafion солями алкиламмония, отмерьте трехкратный молярный избыток соли алкиламмония бромида относительно сульфогрупп в полимере nafion.

Энергично перенесите соль алкиламмонийбромида в стеклянный флакон. В течение примерно 30 секунд интенсивно встряхивайте флакон с 5% (масс./об.) суспензией Nafion, чтобы обеспечить равномерное распределение Nafion в растворе. С помощью пипетки отберите 2 mL ресуспендированного Nafion и добавьте его в стеклянный флакон с солью алкиламмонийбромида.

Перемешивайте содержимое флакона на вортексе при 900 RPM в течение 10–15 минут. Затем перелейте вязкий раствор в пластиковый навесной лодочек и с помощью пипетки перенесите остатки раствора из флакона в лодочек. В данном примере навесной лодочек частично накрывают и оставляют на лабораторном столе для полного испарения растворителей, что при данной скорости испарения занимает более шести часов.

Полное испарение всего растворителя с соответствующей скоростью должно привести к образованию желтой или коричневой прозрачной пленки на дне взвешивающего лотка, как показано здесь. Если растворитель испаряется слишком быстро, вместо прозрачной пленки образуется корка или кристаллический материал, что указывает на разрушение мицеллярной структуры полимера. Если испарение растворителя происходит слишком медленно или если соль аммония реагирует слишком долго и поглощает избыточное количество водяного пара, образуется либо липкий оранжевый гель, либо белый кристаллический материал.

В любом случае процедуру необходимо начать заново. После того как весь растворитель испарится с соответствующей скоростью, залейте в весовую форму от 10 до 20 миллилитров деионизированной воды с удельным сопротивлением 18 mega ohm centimeter и оставьте для замачивания на 12–24 часа, чтобы удалить избыток солей бромида алкиламмония и HBR. Через 12–24 часа удалите воду с помощью пипетки и снова долейте деионизированную воду до заполнения формы. Будьте осторожны и всегда отбирайте жидкость пипеткой в стороне от полимерной пленки, чтобы избежать ее потери.

Промойте образец в общей сложности три раза. Оставьте лоток для взвешивания открытым до полного высыхания полимера. После полного высыхания полимер должен представлять собой прозрачную и несколько хрупкую пластиковую пленку.

Напротив, полимеры, которые не были надлежащим образом высушены, после экстракции солью будут иметь совершенно иной вид, как показано здесь. С помощью шпателя осторожно снимите высушенную пленку с весового лотка и перенесите ее в чистый стеклянный флакон. Добавьте 2 мл этанола и три керамических перемешивающих шарика, затем перемешивайте на вортексе в течение четырех часов или до полного ресуспендирования полимерной пленки.

Раствор наночастиц с модификацией алкиламмонием теперь готов к использованию для иммобилизации фермента. Если используемый фермент находится в сухом виде, отвешивают 1 mg фермента в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 ml и добавляют 1 ml 100 mM фосфатного буфера с pH 7 для приготовления раствора фермента с концентрацией 1 mg/ml. Переносят 120 µL раствора фермента (1 mg/ml) в новую пробирку.

Добавьте 60 µL модифицированного Nafion раствора с аммонием ALK и перемешайте на вортексе в течение 10 секунд. Если данную смесь необходимо масштабировать для большого количества повторностей, следует соблюдать соотношение фермента к полимерному раствору как два к одному. В завершение дозируйте пипеткой по 60 µL раствора фермента и полимера на дно каждой из трех отдельных кювет площадью одна квадратный сантиметр и оставьте их до полного высыхания на ночь.

Стабильность фермента в полимерной пленке затем можно оценить с помощью анализов ферментативной активности, как показано в данной работе. Чтобы начать этот анализ, добавьте в кювету с отлитым модифицированным полимером нафионом и НАД-зависимой дегидрогеназой следующие реагенты: 1.3 milliliters 50 millimolar пирофосфата натрия, 1.5 milliliters свежеприготовленного 15 millimolar никотинамидадениндинуклеотида (NAD) и 0.1 milliliters воды.

Поместите кювету в УФ-видимый спектрофотометр, настроенный на длину волны 340 нм, и обнулите прибор. Добавьте в кювету 0,1 мл этанола и перемешайте реагенты, осторожно пропипетировав раствор пять раз. Для холостой пробы вместо 0,1 мл этанола используйте 0,1 мл дополнительной воды. Через пять минут после добавления реагентов в кювету измерьте оптическую плотность при 340 нм.

Снова измерьте оптическую плотность через 20 минут после добавления реагентов в кювету; эти две точки данных будут использованы для построения графика и определения наклона, который необходим для расчета удельной ферментативной активности иммобилизованного PQQ. Для анализа активности PQQ-зависимых дегидрогеназ дозируйте следующие реагенты в кювету, изготовленную совместно с модифицированным полимером Nafion и PQQ-зависимой дегидрогеназой: 1.5 milliliters натрий-фосфатного буфера и 200 microliters 600 micromolar фенилметилсульфата или PMS.

Поместите кювету в УФ-видимый спектрофотометр, настроенный на длину волны 600 нанометров, и обнулите прибор. Добавьте 100 µL смеси, состоящей из 700 µL 2,6-дихлорфенолиндолевой кислоты (DCIP) и 200 µL интересующего субстрата. Для приготовления холостой пробы перемешайте реагенты, аккуратно пропипетировав раствор вверх-вниз пять раз.

Используйте 200 µL воды вместо исследуемого субстрата. Через пять минут после добавления реагентов измерьте оптическую плотность при 600 нм.

Снова измерьте оптическую плотность через 20 минут после добавления реагентов для начала этого анализа. Добавьте к Q VET, совместно отлитому с модифицированным полимером Nafion и глюкозооксидазой, два миллилитра раствора, содержащего следующее: 0,2 М пара-гидроксибензойной кислоты, 0,02% азида натрия, 128 ед. пероксидазы, 0,3 мМ 4-аминоантипирина, 1 М калия фосфата и 50 мМ глюкозы.

Приготовьте раствор, пять раз произведя перемешивание путем всасывания и вытеснения жидкости пипеткой. Поместите Q vet в УФ-видимый спектрофотометр, настроенный на длину волны 510 нанометров. Снимки делают через пять минут после добавления реагентов в qve.

Измерьте оптическую плотность при 510 нанометрах. Затем снова измерьте оптическую плотность через 20 минут после добавления реагентов. В данной таблице представлены результаты анализа активности NAD-зависимой глюкозодегидрогеназы, иммобилизованной на модифицированных полимерах нафиона.

Было отмечено, что иммобилизованная НАД-зависимая глюкозодегидрогеназа обладала более низкой удельной активностью, чем раствор фермента в буфере. Это объясняется тем, что полимерные мембраны затрудняют транспорт крупных молекул, и хотя глюкоза, являющаяся субстратом для анализа, имеет малый размер, коферменту НАД необходимо диффундировать внутрь и наружу мембраны. Для НАД-зависимой дегидрогеназы ограничение транспорта, вызванное иммобилизацией в полимере, снижает наблюдаемую ферментативную активность.

В следующей таблице представлены результаты анализа активности PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы, иммобилизованной на различных модифицированных полимерах нафиона. Следует отметить более высокую активность ферментов, иммобилизованных на большинстве пленок нафиона, по сравнению с ферментами в буферном растворе. Поскольку PQQ-зависимая глюкозодегидрогеназа является мембраносвязанным белком, гидрофобный модифицированный мицеллярный нафион обеспечивает более схожую с мембраной среду для стабилизации активной PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы, что повышает активность фермента.

Наконец, приведены репрезентативные результаты анализа специфической активности глюкозооксидазы. В данной таблице представлены иммобилизованные и отобранные модифицированные полимеры на основе нафиона. Ферментативный анализ каждого из полимеров с каждым из трех ферментов показывает, что тенденции относительной специфической активности по сравнению с ферментом и раствором зависят от ферментной системы.

Следовательно, необходимо оптимизировать подбор конкретного полимера для каждого фермента. При выполнении данной процедуры важно помнить, что этап высушивания является критическим для данного конкретного метода.