Обнаружение микроРНК в Микроглия по ПЦР в реальном времени в нормальном ЦНС и во время Neuroinflammation

Общая цель этой процедуры — проанализировать экспрессию микроРНК в микроглии. Это достигается путем сначала рассечения головного и спинного мозга, а затем гомогенизации центральной нервной системы или ткани ЦНС. На втором этапе мононуклеарные клетки из ЦНС изолируются с помощью позвонкового градиента, а затем микроглиальная популяция идентифицируется по фактам.

Далее выделяют микроглиальную РНК и анализируют качество образца. Наконец, проводится ПЦР в реальном времени для конкретной микроРНК, представляющей интерес. В конечном счете, метод дельта-дельта КТ может быть использован для отображения относительного уровня экспрессии определенной микроРНК в микроглии.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за того, что им не удается выделить достаточное количество мононуклеарных клеток из ЦНС или из-за того, что образец загрязнен, миелин и клеточный мусор. Оба случая приводят к низкому качеству препарата, но либо к низкой концентрации РНК, либо к загрязнению белком соответственно. Демонстрировать процедуру буду я и вир.

Доктор О Стипендиат из После перфузии всех мышей, препарируйте головной и спинной мозг. Затем поместите по одному головному и одному спинному мозгу за раз в 15-миллилитровый гомогенизатор, добавляя пять миллилитров PBS в ткани каждый раз. После выполнения от 10 до 20 легких ударов пропустите однородные через 70 микронные ячеистые фильтры в отдельные 50-миллилитровые конические пробирки и центрифугируйте пробирки в течение пяти-семи минут при температуре 834 G и четырех градусах Цельсия.

После отбрасывания надосадочной жидкости Ресус суспендируют головной и спинной мозг в однородном состоянии от двух-трех мышей в пять-семь миллилитров по 70% за один вызов. Затем налейте семь миллилитров 40% на вызов и вращайте раствор для каждого звонка и ячейки в течение 30 минут при 850-кратной G 20 градусов Цельсия без перерыва. Выбросьте поврежденные клетки, километр и мусор в верхней части 70% за вызов.

Затем соберите мононуклеарные элементы на границе между 70% и 40% на вызов растворами и разбавьте собранные ячейки в PBS, по крайней мере, в соотношении один к одному. После вращения клеток восстановите гранулы в половине миллилитра PBS и перенесите их в 1,7-миллилитровую эйноровую трубку. Начните с переноса 50 микролитров отсортированных по градиенту плотности клеток в новую эйноровую трубку объемом 1,7 миллилитра и добавьте в пробирку 350 микролитров факсимильного буфера.

Затем, добавив от пяти до 10 микролитров антител против FCR в пробирку, инкубируйте клетки в течение 10-15 минут на льду. Разделите образец клетки на две эйноровые пробирки в одну пробирку. Добавьте один микролитр антител против CD 11 B и два микролитра антител против CD 45.

Инкубация клеток еще от 10 до 15 минут на льду. Пометьте вторую пробирку отрицательным контролем и положите ее на лед. После инкубации с окрашивающими антителами добавьте один миллилитр факс-буфера в обе пробирки и вращайте клетки в микроцентрифуге в течение пяти минут со скоростью 1200 раз.

Затем закрепите гранулы в 400 микролитрах 1% параформальдегида в PBS и закрутите трубки, чтобы предотвратить комкование. Наконец, проанализируйте клетки с помощью проточной цитометрии с использованием отрицательного образца контрольной клетки и гранул BD com, начните с подкожной иммунизации группы из 5-10, 8-12-недельных черных шести мышей C 57 со 150 мг пептида MOG 35-55 в четырех мг на миллилитр полного адъюванта для индукции EAE. Затем введите коклюшный токсин внутрибрюшинно на нулевой день и на второй день после иммунизации.

После выделения и окрашивания клеток, как показано только что на рисунке, суспендируйте гранулы в 400 микролитрах PBS вместо фиксирующего средства непосредственно перед сортировкой. Затем заполните две 1,7-миллилитровые эйноровые пробирки 300 микролитрами PBS с добавлением 10% FBS для сбора образцов. Наконец, отсортируйте популяции микроглии и макрофагов по высокой чистоте, используя стратегию стробирования, проиллюстрированную на этом репрезентативном графике плотности.

После сортировки повторно проанализируйте популяции микроглии и макрофагов, чтобы определить чистоту выделенных образцов клеток. После вращения отсортированных клеточных популяций в 1200 раз G в течение пяти-семи минут в микроцентрифуге осторожно удалите надосадочную жидкость и заморозьте клеточные гранулы на сухом льду. Далее переложите замороженные клеточные гранулы на обычный лед.

Для размораживания добавьте 300 микролитров буфера для лизиса из набора Nirvana, а затем аккуратно перемешайте клеточный раствор пипетированием пять-семь раз. Затем добавьте 30 микролитров гомогенатной добавки, перебейте клеточную суспензию на 30 секунд, а затем поместите пробирки на лед на 10 минут. Теперь добавьте 300 микролитров кислоты, фенола, хлороформа и закрутите трубку еще на 30 секунд.

Затем, после вращения ячеек в течение пяти минут при 9,500-кратном G, осторожно перенесите верхние 300 микролитров надосадочной жидкости, содержащей водную фазу, в новую 1,7-миллилитровую эйноровую трубку. Смешайте раствор с 375 микролитрами 100% этанола. Переложите все содержимое пробирки в фильтрующий картридж из набора Nirvana и вращайте картридж в течение одной минуты с температурой 9 500 G. Затем выбросьте проточный буфер.

Добавьте 700 микролитров моющего раствора один из набора Nirvana, и крутите еще минуту при 9,500 G после стирки картриджа. Еще два раза с 500 микролитрами раствора для стирки. Два из набора Nirvana Elute, РНК из картриджа с 60 микролитрами предварительно нагретой нуклеазной воды.

Наконец, используйте спектрофотометр NanoDrop для оценки чистоты и количества РНК после выполнения Q-R-T-P-C-R в реальном времени для обнаружения микроРНК в образцах микроглии и макрофагов. Кривые P-R-T-P-C-R для флуоресцентно меченых продуктов ПЦР MERE 1:24 и РНК снега 55 могут быть созданы, как показано на первом графике. Приведены типичные кривые для количества флуоресцентно меченных специфических продуктов ПЦР для образцов РНК 55 контрольного снега, выделенных из микроглии или макрофагов, полученных из костного мозга, в сравнении с количеством циклов ПЦР.

Обратите внимание, как значения CT для анализа экспрессии снежной РНК 55 из различных клеточных популяций определяются на пересечении базовой линии с нижней частью линейного диапазона кривых Q-R-T-P-C-R, как показано на графике зелеными и синими вертикальными линиями. На этом втором графике показано количество флуоресцентно меченных специфических продуктов ПЦР для экспериментальных образцов всего 1 24 РНК из микроглии или макрофагов, полученных из костного мозга, по сравнению с количеством циклов ПЦР. Обратите внимание, как значения КТ для анализа экспрессии всего 1:24 из различных клеточных популяций снова определяются на пересечении базовой линии с нижней частью линейного диапазона кривых Q-R-T-P-C-R, как показано на графике зелеными и синими вертикальными линиями.

После определения значений CT для каждого из образцов, как для РНК снега 55 и экспрессии всего 1 24 в микроглии и BM dms у нормальных мышей и мышей EAE, показанных в этой таблице, вычтите значение CT для контрольной снежной РНК 55, образец из значения CT для экспериментального образца всего 1 24 для расчета дельта значений CT для каждого дубликата каждого образца. Затем вычтите дельта CT эталонного образца из значений дельта CT других образцов, чтобы рассчитать значения дельта и дельта CT. Наконец, относительный уровень экспрессии для каждого образца вычисляется как два в степени минус дельта дельта CT, как показано на этом графике плотности.

В случае хорошего выделения микроглии из нормальной ЦНС, от 95 до 98% клеток будут представлять CD 11 B положительную CD 45 низкую микроглию, при этом от двух до 5% клеточной суспензии будут состоять из CD 11 B положительного CD 45 высоких периваскулярных макрофагов менее 1% CD 11 B отрицательного CD 45 высоких лимфоцитов или CD 11 B отрицательного CD 45 отрицательного астроглии или олиго DRO глиальных клеток или фрагменты клеток будут присутствовать сравнительно в плохом препарате. Существует значительная контаминация CD 11 B, отрицательных CD 45 отрицательных клеток или фрагментов клеток, таких как астроглия или частицы миелина, что делает клетки непригодными для выделения РНК и дальнейшего анализа. Кроме того, на этом рисунке показаны три популяции клеток, присутствующих в ЦНС во время нейровоспаления: CD 11 B положительный CD 45, низкий уровень микроглии CD 11 B положительный CD 45 высоких макрофагов и CD 11 B отрицательный CD 45 высоких лимфоцитов.

Показано качество РНК, определяемое с помощью гель-электрофореза после хорошей и плохой изоляции. Когда РНК выделена чистым способом, РНК-лестница и рибосомная РНК очевидны, когда процесс выделения выполнен плохо, мазок и очевидны продукты деградации с низкой молекулярной массой. Эти окончательные данные демонстрируют экспрессию всего 1:24 у нормальных взрослых микроглий мышей с ЭАЭ и микроглией, выделенной от мышей на ранних стадиях развития.

На этом первом столбчатом графике относительная экспрессия всего 1:24 намного больше в микроглии из нормальной ЦНС по сравнению с макрофагами, полученными из костного мозга. Аналогичным образом, несмотря на увеличение всего лишь 1 24 РНК в макрофагах из ЦНС мышей с микроглией EAE, она все еще экспрессирует в пять раз большее количество всего лишь 1 24 РНК. Эта заключительная гистограмма демонстрирует, как изменения в уровне экспрессии всего 1:24 в микроглии во время развития мышей в возрасте одной, двух и четырех недель по сравнению со взрослыми восьминедельными мышами также могут быть оценены с помощью этого метода при попытке проведения процедуры.

Важно помнить о наличии достаточного количества и хорошего качества выделенных клеток, что будет гарантировать хорошие результаты на протяжении всего эксперимента.