Обнаружение микроРНК в Микроглия по ПЦР в реальном времени в нормальном ЦНС и во время Neuroinflammation

Общая цель данной процедуры — анализ экспрессии микроРНК в микроглии. Для этого сначала проводят диссекцию головного и спинного мозга, после чего гомогенизируют ткани центральной нервной системы (ЦНС). На втором этапе методом центрифугирования в градиенте плотности выделяют мононуклеарные клетки ЦНС, а затем с помощью FACS идентифицируют популяцию микроглии.

Затем проводят выделение РНК микроглии и анализ качества полученного образца. В завершение выполняется ПЦР в реальном времени для определения экспрессии конкретной интересующей микроРНК. В итоге для расчета относительного уровня экспрессии данной микроРНК в микроглии может быть использован метод delta-delta CT.

Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями из-за того, что им не удается выделить достаточное количество мононуклеарных клеток из ЦНС или из-за загрязнения образца миелином и клеточным дебрисом. В обоих случаях это приводит к низкому качеству препарата: либо к низкой концентрации РНК, либо, соответственно, к загрязнению белком. Процедуру будут демонстрировать я и vir.

После перфузии всех мышей выделите головной и спинной мозг. Затем помещайте по одному образцу головного и спинного мозга в 15-миллилитровый гомогенизатор, каждый раз добавляя к тканям 5 мл PBS. После 10–20 осторожных нажатий пропустите гомогенат через клеточный фильтр с размером пор 70 мкм в отдельные 50-миллилитровые конические пробирки и центрифугируйте пробирки в течение 5–7 минут при 834 ×g и 4 °C.

После удаления супернатанта ресуспендируйте гомогенат головного и спинного мозга двух-трех мышей в 5–7 мл 70% Percoll. Затем аккуратно нанесите слой 7 мл 40% Percoll и центрифугируйте раствор Percoll с клетками в течение 30 минут при 850 ×g и 20 °C без торможения. Удалите поврежденные клетки, миелин и клеточный дебрис, скопившиеся в верхнем слое 70% Percoll.

Затем соберите мононуклеарные клетки из интерфейса между 70% и 40% растворами Percoll и разбавьте собранные клетки в PBS, как минимум в соотношении один к одному. После центрифугирования клеток ресуспендируйте осадок в 0.5 мл PBS и перенесите их в микроцентрифужную пробирку объемом 1.7 мл. Начните с переноса 50 µL клеток, разделенных методом градиентного центрифугирования, в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1.7 мл и добавьте в пробирку 350 µL буфера FACS.

Затем, добавив в пробирку от 5 до 10 µL антител к FCR, инкубируйте клетки в течение 10–15 минут на льду. Разделите образец клеток между двумя пробирками Эппендорф; в одну из них добавьте 1 µL антител к CD 11 B и 2 µL антител к CD 45.

Инкубируйте клетки на льду еще в течение 10–15 минут. Промаркируйте вторую пробирку как отрицательный контроль и поместите ее на лед. После инкубации с окрашивающими антителами добавьте один миллилитр FACS-буфера в обе пробирки и центрифугируйте клетки в микроцентрифуге в течение пяти минут при 1200 ×g.

G. Затем зафиксируйте осадок в 400 µL 1% параформальдегида в PBS и перемешайте пробирки на вортексе, чтобы предотвратить образование комочков. В завершение проанализируйте клетки методом проточной цитометрии, используя образец клеток отрицательного контроля и BD com beads. Начните с подкожной иммунизации группы из пяти-десяти мышей C 57 black six в возрасте 8-12 недель 150 mg пептида MOG 35-55 в 4 mg/mL полного адъюванта Фройнда для индукции EAE. Затем введите коклюшный токсин внутрибрюшинно в день 0 и на второй день после иммунизации.

После выделения и окрашивания клеток, как было показано ранее, непосредственно перед сортировкой суспендируйте осадки в 400 µL PBS вместо фиксатора. Затем наполните две пробирки объемом 1,7 мл 300 µL PBS с добавлением 10% FBS для сбора образцов. Наконец, проведите сортировку популяций микроглии и макрофагов до достижения высокой чистоты, используя стратегию гейтирования, представленную на данном репрезентативном графике плотности.

После сортировки повторно проанализируйте популяции микроглии и макрофагов, чтобы определить степень чистоты выделенных образцов клеток. После центрифугирования отсортированных популяций клеток при 1200 ×g в течение пяти-семи минут в микроцентрифуге осторожно удалите супернатант и заморозьте клеточные осадки на сухом льду. Затем перенесите замороженные клеточные осадки на обычный лед.

Для размораживания добавьте 300 µL лизирующего буфера из набора Nirvana, затем аккуратно перемешайте клеточную суспензию, прокачав ее через пипетку пять-семь раз. Затем добавьте 30 µL добавки для гомогенизации, перемешайте клеточную суспензию на вортексе в течение 30 секунд и поместите пробирки на лед на 10 минут. Теперь добавьте 300 µL смеси кислого фенола и хлороформа и снова перемешайте пробирку на вортексе в течение 30 секунд.

После центрифугирования клеток в течение пяти минут при 9 500 ×g осторожно перенесите верхние 300 µL супернатанта, содержащего водную фазу, в новую пробирку типа «эппендорф» объемом 1,7 мл. Смешайте раствор с 375 µL 100% этанола. Перенесите все содержимое пробирки в фильтр-картридж из набора Nirvana и центрифугируйте картридж в течение одной минуты при 9 500 ×g. Затем удалите фильтрат.

Добавьте 700 µL промывочного раствора 1 из набора Nirvana и центрифугируйте еще одну минуту при 9 500 ×g после промывки картриджа. Повторите процедуру еще два раза, используя по 500 µL промывочного раствора 2 из набора Nirvana. Элюируйте РНК из картриджа, используя 60 µL предварительно нагретой воды, свободной от нуклеаз.

Наконец, используйте спектрофотометр NanoDrop для оценки чистоты и количества РНК после проведения ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (Q-R-T-P-C-R) для обнаружения микроРНК в образцах микроглии и макрофагов. Кривые ПЦР для флуоресцентно меченных продуктов ПЦР mere 1 24 и snow RNA 55 могут быть построены, как показано здесь на первом графике. Представлены типичные кривые зависимости количества специфических флуоресцентно меченных продуктов ПЦР для контрольных образцов snow RNA 55 РНК, выделенных из микроглии или макрофагов костного мозга, от числа циклов ПЦР.

Обратите внимание, что значения CT для анализа экспрессии snow RNA 55 в различных популяциях клеток определяются в точке пересечения базовой линии с нижней частью линейного диапазона кривых Q-R-T-P-C-R, что отмечено на графике зелеными и синими вертикальными линиями. На этом втором графике показано количество специфических флуоресцентно меченных продуктов ПЦР для экспериментальных образцов mere 1 24 RNA из микроглии или макрофагов костного мозга в зависимости от числа циклов ПЦР. Обратите внимание, что значения CT для анализа экспрессии mere 1 24 в различных популяциях клеток снова определяются в точке пересечения базовой линии с нижней частью линейного диапазона кривых Q-R-T-P-C-R, что отмечено на графике зелеными и синими вертикальными линиями.

После определения значений CT для каждого из образцов, таких как экспрессия snow RNA 55 и mere 1 24 в микроглии и BM dms мышей нормальной группы и группы EAE, представленных в этой таблице, вычтите значение CT контрольного образца snow RNA 55 из значения CT экспериментального образца mere 1 24, чтобы рассчитать значения delta CT для каждого дубликата каждого образца. Затем вычтите delta CT референсного образца из значений delta CT остальных образцов, чтобы рассчитать значения delta delta CT. Наконец, относительный уровень экспрессии для каждого образца рассчитывается как два в степени минус delta delta CT, как показано на этом графике плотности.

При качественном выделении микроглии из нормальной ЦНС от 95% до 98% клеток будут представлять собой CD 11 B-положительную CD 45-низкую микроглию, при этом от 2% до 5% клеточной суспензии будут составлять CD 11 B-положительные CD 45-высокие периваскулярные макрофаги, а менее 1% — CD 11 B-отрицательные CD 45-высокие лимфоциты или CD 11 B-отрицательную CD 45-отрицательную астроглию, олигодендроглиальные клетки или фрагменты клеток. В случае некачественной подготовки наблюдается значительное загрязнение CD 11 B-отрицательными CD 45-отрицательными клетками или фрагментами клеток, такими как астроглия или частицы миелина, что делает клетки непригодными для изоляции РНК и дальнейшего анализа. Кроме того, могут присутствовать CD 11 B-отрицательные CD 45-высокие клетки, что указывает на загрязнение лимфоцитами крови из-за недостаточной перфузии. На данном графике плотности показаны три популяции клеток, присутствующие в ЦНС при нейровоспалении: CD 11 B-положительная CD 45-низкая микроглия, CD 11 B-положительные CD 45-высокие макрофаги и CD 11 B-отрицательные CD 45-высокие лимфоциты.

Представлено качество РНК, определенное с помощью гель-электрофореза, после качественной и некачественной изоляции. При чистой изоляции РНК четко видны маркер РНК и рибосомальная РНК; если процесс изоляции проведен плохо, наблюдается шлейф и продукты деградации с низкой молекулярной массой. Эти конечные данные демонстрируют экспрессию mere 1 24 в нормальной микроглии взрослых особей, микроглии мышей с ЭАЭ и микроглии, выделенной из мышей на ранних стадиях развития.

На этом первом столбчатом графике относительная экспрессия mere 1 24 в микроглии нормальной ЦНС значительно выше по сравнению с показателями для макрофагов, полученных из костного мозга. Аналогично, несмотря на увеличение количества РНК mere 1 24 в макрофагах из ЦНС мышей с ЭЭА, в микроглии все еще экспрессируется в пять раз больше РНК mere 1 24. Этот последний столбчатый график демонстрирует, как с помощью данного метода в ходе выполнения процедуры можно оценить изменения уровня экспрессии mere 1 24 в микроглии при развитии мышей в возрасте одной, двух и четырех недель по сравнению с взрослыми мышами в возрасте восьми недель.

Важно помнить, что для обеспечения успешных результатов всего эксперимента необходимо иметь достаточное количество и высокое качество изолированных клеток.