Обработка первичной опухолевой ткани мозга для стволовых клеток Анализы и поток Сортировка

Общая цель этой процедуры заключается в изучении клеток, инициирующих опухоль головного мозга, in vitro. Это достигается путем механической и ферментативной диссоциации первичных опухолей человека, а затем культивирования их в условиях свободной культивирования сыворотки стволовых клеток. Следующее формирование сферы контролируется в течение трех-пяти дней.

Затем опухолевые сферы снова ферментативно расщепляются, а их поверхностные маркеры оцениваются с помощью проточной цитометрии. Заключительным этапом является сортировка нужных ячеек по 96 луночным планшетам или слайдам сетки PL для дальнейшей характеризации. В конечном счете, способность к самообновлению и дифференциальная экспрессия генов отсортированной популяции могут быть оценены с помощью анализа предельного разведения и R-T-P-C-R для одной клетки.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как анализ объемных опухолей, заключается в том, что он проспективно изолирует опухоль головного мозга, инициирующую популяции клеток или раковых стволовых клеток. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы применили условия культивирования, первоначально использованные для нормальных нейральных стволовых клеток, к различным опухолям головного мозга человека, и обнаружили, что этот метод культивирования специально выбран для популяций, подобных стволовым клеткам, демонстрируя эту процедуру, будут постдокторантами-исследователями CHITRA AL, аспирантами Браном Ван Маненом и Сарой Нолти. и наш техник по проточной цитометрии Николь Макфарланд из нашей лаборатории Начните с добавления 200 микролитров размороженной лиазы к 15 миллилитрам искусственной спинномозговой жидкости или спинномозговой жидкости или спинномозговой жидкости, а затем поместите трубку в водяную баню при температуре 37 градусов по Цельсию. В это время также доведите раствор хлорида аммония до комнатной температуры.

Затем при введении пяти миллилитров ликвора в контейнер для образцов ткани опухоли головного мозга поверните контейнер для промывки, а затем откачайте из него жидкость, чтобы удалить эритроциты. Теперь перенесите ткань в стерильную 100-миллиметровую чашку Петри и с помощью тонких ножниц и щипцов разложите ткань до кашицеобразной консистенции. Затем соберите образец с помощью обычной пипетки объемом 10 миллилитров и щипцов и перенесите фрагменты ткани в пробирку, содержащую предварительно подогретый ликвор А.

С помощью лиаза поместите пробирку на шейкер инкубатора при 30 оборотах в минуту и 37 градусах Цельсия. А затем через 15 минут отфильтруйте лизат тканей через клеточное сетчатое фильтр с температурой семь D микрометров в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Уменьшите фильтрат в течение пяти минут при температуре 280 GS при комнатной температуре.

Затем аккуратно извлеките сныть и оцените размер и цвет полученной гранулы. Затем повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре PBS, а затем добавьте соответствующее количество раствора хлорида аммония в зависимости от размера гранул и загрязнения эритроцитами. Затем, после пятиминутной инкубации при комнатной температуре, раскрутите клетки после второй промывки в PBS, ресуспендируйте гранулу в пяти миллилитрах полной среды нейростволовых клеток, а затем перенесите клеточную суспензию в 60-миллиметровую тканевую культуральную пластину со сверхнизкой связываемостью в течение первых нескольких дней.

Доливайте в культуры один-два миллилитра среды по мере необходимости, меняя среду только тогда, когда цвет станет слегка желтым. Начните с переноса культуры опухолевой сферы в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Добавьте два-три миллилитра стерильного PBS, чтобы тщательно промыть пластину, а затем добавьте промывку в опухолевую трубку.

После раскручивания клеток удалите снат и ресуспендируйте гранулу в одном-двух миллилитрах стерильного PBS, а затем добавьте 10 микролитров лиазы. Одной из задач этого метода является поддержание жизнеспособности стволовых клеток солидных опухолей во время обработки. Любые манипуляции с клетками во время культивирования и посева требуют нежного прикосновения.

Далее инкубируйте трубку на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Через три минуты снимите и визуально оцените подвес. Если вы видите несколько скоплений, используйте наконечник для пипетки объемом 1000 микролитров, чтобы аккуратно перемешать кластер клеток.

Теперь промойте клетки в пяти миллилитрах стерильного PBS, а затем, удалив надосадочную жидкость S, повторно суспендируйте гранулу в 500-1000 микролитрах стерильного PBS плюс два миллимоляра ЭДТА. Наконец, после оценки количества клеток и жизнеспособности с помощью трианового синего отрегулируйте количество клеток до 1 миллиона клеток на миллилитр в PBS плюс EDTA. Начните с переноса 100 микролитров клеточной суспензии на тест в отдельные проточные трубки размером 12 на 75 миллиметров.

После добавления соответствующих антител инкубируйте образцы на льду в течение 30 минут, затем смойте все несвязанные антитела в двух миллилитрах PBS плюс EDTA на пробирку. Теперь сцедите раствор для промывки, промокните пробирки, а затем повторно суспендируйте клеточные гранулы еще в 300 микролитрах PBS плюс EDTA. Затем добавьте 10 микролитров из семи красителей для жизнеспособности A и D в каждую тюбик.

После инкубации пробирок в течение не менее 15 минут на льду клетки готовы к проточному цитометрическому анализу. После использования отрицательного контрольного образца для настройки параметров прямого и бокового рассеивания, нарисуйте область вокруг интересующих ячеек, аналогичную той, что показана на этом репрезентативном верхнем графике. При необходимости отрегулируйте напряжение на флуоресцентных детекторах, используемых для размещения отрицательных ячеек в течение первых двух декад.

Затем используйте краситель для обеспечения жизнеспособности семь A a d для создания второй области для исключения мертвых клеток, аналогичной области, показанной на этом репрезентативном верхнем графике. Затем примените вентили рассеяния и затворы живых ячеек ко всем флуоресцентным графикам и используйте элементы управления с одним окрашиванием для вычитания любого спектрального перекрытия. Наконец, запустите примеры.

Анализ предельного разведения начинают с сортировки диссоциированных клеток при различном разведении до одной клетки на лунку в отдельные лунки 96-луночного планшета, содержащего 200 микролитров среды НСК, которые нейросферы обычно формируют в течение семи дней, и скорость последующего образования сфер за последние семь дней в культуре может быть рассчитана для одной клетки R-T-P-C-R. После сортировки отдельных клеток из интересующих популяций по реакционным участкам предметного стекла с широкой сеткой, добавьте один микролитр мастер-смеси в центр каждого реакционного участка, а затем немедленно покройте каждый участок пятью микролитрами потолочного раствора. Затем с помощью амплификатора с достаточной скоростью инкубируйте затвор в течение трех температурных циклов.

После обратной транскрипции добавьте три микролитра воды, свободной от раза DN a, в каждый участок реакции. Затем перенесите всю смесь из каждого реакционного участка в отдельные пробирки для ПЦР. Наконец, для количественной оценки в режиме реального времени запустите образцы на амплификаторе BioRad.

На первом рисунке показана магнитно-резонансная томография пациента с глиобластомой. Диссоциированные опухолевые клетки могут быть помечены маркерами стволовых клеток нервной поверхности, CD 1 33 и CD 15 и проанализированы с помощью проточной цитометрии, как показано на этой репрезентативной точечной диаграмме. Здесь показан график амплификации для репрезентативной реакции R-T-P-C-R одной клетки.

Значения CT, полученные на таком графике, могут быть использованы для расчета относительных уровней экспрессии интересующих генов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как ферментативно диссоциировать и культивировать первичную опухолевую ткань мозга для обогащения популяциями стволовых клеток. Вы также узнаете, как изучать способность к самообновлению и дифференциальную экспрессию генов отсортированных популяций стволовых клеток, выполняя анализ предельного разведения или R-T-P-C-R для одной клетки.