Поколение, очистка и характеристика Cell-инвазивных видов белка DISC1

Общей целью следующих процедур является получение очищенного диска. Один агрегат способен проникать в клетки-реципиенты. В первом методе будут продемонстрированы два различных метода достижения этой цели.

Образующий асомы флуоресцентный белок Disc One Fusion белок чрезмерно экспрессируется в донорских клетках нейробластомы человека NLF. Затем клетки промывают собранным PBS и лежат без использования моющих средств. ДНК переваривается, а агрозоны очищаются с помощью системы градиента сахарозы.

Очищенные этим методом агриосы имеют низкую эффективность клеточной инвазии. Альтернативный подход заключается в сверхэкспрессии аминокислот от 5 98 до 7 85 из белка рекомбинантного диска 1 в кишечной палочке. Затем фрагмент белка мечут DITE 594, диализуют и очищают с использованием матрицы NI NTA, которая удаляет любой оставшийся несвязанный мультимерный диск красителя.

Один фрагмент, полученный этим методом, обладает высокой эффективностью клеточной инвазии для оценки инвазии клетки-хозяина. Либо очищенный флуоресцентный белковый диск, либо один рисом, либо меченый рекомбинантный диск. Один фрагмент инкубируется с представляющими интерес клетками-реципиентами.

Затем добавляется триановый синий для гашения внеклеточной флуоресценции, и инвазия визуализируется с помощью конфокальной микроскопии. До сих пор агрегация белков не была признанной особенностью хронических психических заболеваний, таких как шизофрения. В тех случаях, когда нарушенный при шизофрении один белок является кандидатом в клетки, инвазивность белковых агрегатов является отличительной чертой для белковых конфирмационных заболеваний.

Здесь мы показываем с помощью двух методов, что агрегаты белка диска являются клеточно-инвазивными и, следовательно, связанные с диском 1 расстройства или невропатии диска являются нарушениями подтверждения белка. Эти два метода заключаются, во-первых, в очищении полноразмерного диска, в одном ASOS от клеточных линий нейробластомы и, во-вторых, в экспрессии С-концевого мультимерного диска. Один фрагмент в кишечной палочке, а также очистка и мечение флуоресцентным красителем.

В то время как первый метод приводит к низкой эффективности клеточной инвазии только 0,3% клеток, поглощающих очищенные микросомы, фрагмент рекомбинантного белка пура инфицирует до 20% подвергшихся воздействию клеток. Описанные здесь методы должны быть переносимы на другие белки, где было убедительно продемонстрировано образование акросом или мультимерная сборка. В каждой по 10 10 сантиметровых посуд.

Засейте в 1,5 раза по 10 шести клеток нейробластомы человека и LF в добавке среды RPMI 1640 и выращивайте в течение ночи. На следующий день клетки должны быть на 70-80% совмещены: пять тарелок для трансфекции ДНК ПК 3.1 MRFP и EGFP помечены человеческим полноразмерным диском один и пять для трансфекции только плазмидой EGFP. На каждую 10-сантиметровую тарелку соедините 15 микрограммов плазмидной ДНК, 30 микролитров встречающихся и 750 микролитров.

Opti MEM помещает в микроцентрифужную пробирку и делает путем пипетирования вверх и вниз, инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем для трансфекции клеток добавляют раствор реагента для трансфекции ДНК, по каплям в клетки инкубируют клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5%СО2 через 48 часов после трансфекции, контролируют экспрессию MRFP по всей длине диска один и подтверждают формирование агрозон под флуоресцентным микроскопом. Некоторые клетки содержат массивные флуоресцентные белковые включения, как показано здесь.

Этот протокол сочетает в себе метод очистки телец Леви из тканей мозга и протокол выделения более крупных агрегатов или агрозон, поскольку уже существующие методы основаны на использовании детергентов, выделение белка без детергентов для применения в анализах на клеточную инвазивность имеет решающее значение. Далее аспирируйте среду PBS и добавьте 400 микролитров PBS, содержащего коктейль ингибиторов протеазы. Затем соскребите клетки и добавьте один миллилитр клеточной суспензии и 10 керамических шариков в двухмиллилитровую лизисную трубку.

Лизует клетки с помощью трех 62-х импульсов на гомогенизаторе pre-cell lyse 24. Механическая сила процесса может повысить температуру внутри образца до уровня выше 37 градусов Цельсия. Так что следует соблюдать осторожность при охлаждении образца на льду После процедуры лизиса, после охлаждения клеток на льду, добавьте 10 миллимоляров хлорида магния 40 единиц на миллилитр ДНК и инкубируйте в течение 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием.

Приготовьте по 10 миллилитров по 80%, 50% и 20% сахарозы на объем в PBS. Затем в конической трубке объемом 15 миллилитров приготовьте градиент сахарозы, начиная с двух миллилитров 80% сахарозы, затем двух миллилитров 50% и двух миллилитров 20% сахарозы. Заливайте градиент медленно и будьте осторожны, чтобы не потревожить уже залитые слои.

Далее выложите переваренный лизат поверх градиента и центрифугируйте в течение 15 минут при температуре 1000 раз G при четырех градусах Цельсия. С отломом осторожно соберите пипеткой границу раздела между 50-80%-ным слоем сахарозы и смешайте с пятью объемами 15-миллилитровой конической пробирочной центрифуги в течение 15 минут при 1000-кратном перегрузке при четырех градусах Цельсия. Осторожно удалите надосадочную жидкость и сохраните в агрозоне гранулы.

Повторите стирку еще два раза в этом интерфейсе. Агрозоны являются флуоресцентными и могут быть визуализированы в микроскоп под ультрафиолетовым светом после последней промывки, отбросить надосадочную жидкость и повторно суспендировать гранулу в 250-500 микролитрах PBS. Эта пеллета содержит очищенные агрозоны.

Добавьте 10 микролитров диска MRFP, по одной суспензии асомы в каждую лунку 24-луночного планшета, содержащего SHSY пять Y клеток нейробластомы человека. Конститутивно экспрессирующий растворимый диск GFP на одном С-конце на стерильной стеклянной крышке скользит и инкубируется в течение 48-72 часов после инкубации. Промойте клетки трижды PBS и погасите внеклеточную флуоресценцию 0,04% трианного синего в течение пяти минут.

Затем промойте PBS, чтобы удалить триановую синеву. Далее поставьте блюдо на лед и добавьте 4% PFA и PBS на 10 минут для фиксации клеток. Затем один раз промыть стерильной водой и закрепить чехол на стекольных стеклах с удлиненным золотом с установочной средой DPI.

Подтвердите принятие в инвазию экзогенно. Применяли агрозоны путем колокализации с рекрутированными белками, экспрессируемыми клетками-реципиентами на изображениях Зака. Этот Зак охватывает примерно шесть микрометров в глубину.

24 снимка сняты с шагом 200 нанометров. Флуоресценция диска MRFP в одной агрозоне, показанная красным цветом, рекрутирует цитозольный концевой диск GFPC. Один фрагмент, показанный зеленым цветом колокализации, представлен желтым цветом и указывает на то, что агрозоны проникли в цитозоль-реципиент и рекрутировали ранее растворимый диск одного белка.

В этой части протокола человеческий диск будет помечен DITE 5 94. Этот D позволяет осуществлять прямой мониторинг рекомбинантного белка без необходимости дополнительного иммуноокрашивания. Начните с высвобождения белка, приготовленного, как описано в сопроводительном документе, из пучка меркаптоэтанола путем трехкратного диализа в двух литрах PBS в разведении от одного до 2000.

Далее пометить один миллиграммовый диск с DITE 5 94 IDE, растворить один миллиграмм на миллилитр белка в PBS и добавить пять миллимолярных TCEP для восстановления свободных TH-групп, добавить в реакцию 20 микролитров растворенного красителя DMF и инкубировать в течение двух часов при комнатной температуре с помощью диализной кассеты SLI с отсечкой по молекулярной массе 10, 000. Дальтоны диализуют белок три раза в PBS в соотношении один к 2000 в течение двух часов каждый раз. Далее для дальнейшего повышения чистоты меченого белка.

Выполняется аффинная очистка на основе метки шипения на колонке NI NTA. Постирайте один миллилитр NI NTA матрицы на 10 миллилитров. Затем PBS нанесите меченый диализный белок на колонку и дайте ему пробежать по колонке.

Постепенно раствор будет терять часть своего синего цвета, из-за связывания белка с матрицей NTA немеченый свободный краситель останется в потоке через него. Как только вводится раствор белка. В колонку промываем колонку три раза 20 миллилитров PBS для элюирования белка, добавляем в колонку два миллилитра PBS, содержащих 500 миллимолярных оле.

Установите клапан на медленную скорость и выбавьте его по каплям, следя за цветной полосой на столбце N NI NTA. Следует отметить, что эта окрашенная фракция элюата содержит меченый рекомбинантный белок, переносит ЭИТ в диализную кассету SLI и диализует ЭИТ три раза до 10 миллимолярных NAPI в разведении от одного до 2000 в течение двух часов каждый на два литра после диализа. Пропустите ЭИТ через стерильный шприцевой фильтр 0,45 микрометра, затем добавьте аликвоту в пять раз по 100 микролитров образцов и заморозьте в жидком азоте.

Общее количество белка должно составлять от 0,5 до одного микрограмма на миллилитр в каждых 100 микролитровых аликвотах. Для оценки инвазивности белка добавляют среду, содержащую от 5 до 10 мкг на миллилитр меченого рекомбинантного диска, по одному белку в каждую лунку 24-луночного планшета, содержащую реципиентные клетки SH SY, пять Y нейробластомы человека. Составляюще экспрессируя растворимый диск GFP-метки на одном С-конце на стерильном стеклянном покрове, пластинки инкубируют от 48 до 72 часов.

Погасить внеклеточную флуоресценцию, зафиксировать и смонтировать клетки, как это было сделано для агрозоны: обработанные клетки подтверждают вторжение экзогенно применяемого рекомбинантного белка с помощью Zack Imaging. Когда меченый белок захватывается, он обнаруживается в периметре клеток-реципиентов на изображениях, полученных с помощью конфокальной микроскопии. Этот Zack охватывает глубину около пяти микрометров с 24 ступенями по 220 нанометров.

Здесь рекомбинантный диск с одним фрагментом от 5 98 до 7 85, показанный красным цветом, поглощается клетками-реципиентами, экспрессирующими растворимый С-концевой диск, помеченный GFP диском, который показан зеленым цветом, для определения инвазивности диска. Один белок агрегатирует агрозоны, состоящие из MRFP, помеченных диском полной длины, один был очищен от NLF-клеток и нанесен реципиенту SH, SY, пяти Y-клеток, как описано на этой фотографии, как показано здесь. A-M-R-F-P меченый диск одна акросома вторглась в нейробластому человека SH SY пять Y-клеток, экспрессирующих растворимый GFP, меченный C терминальный диск один.

Кроме того, меченный MRFP диск один asome смог рекрутировать растворимый диск один, меченный GFP, в нерастворимые агрегаты для определения инвазивности рекомбинантного диска, меченного светом DIA, который был нанесен на клетки нейробластомы SH SY с пятью Y, экспрессирующими растворимый диск GFP, как показано здесь. Рекомбинантный диск один белок, показанный красным цветом, вторгся в клетку-реципиент, желтые точки указывают на рекрутинг растворимого GFP, меченного С-концевым диском один, в агрегаты, помеченный рекомбинантным диском, один экспрессированный и очищенный от кишечной палочки, также был клеточным инвазивным для нейронов in vivo, когда мультимерный белок был стереотаксически введен в медиальную префронтальную кору крысы. Визуализация Зака подтверждает наличие рекомбинантного белка диска один в корковом нейроне крысы, окрашенном антителом против ядер нейронов.

Мы только что показали вам два метода генерации агрегатов disc one для изучения клеточной инвазии. Используя любой из этих методов, мы можем исследовать клеточные эффекты поглощения агрегатов первого диска без потенциально искажающих переменных экспрессии рекомбинантных генов при трансфекции чужеродной ДНК. Эти методы могут быть применены для исследования биологических эффектов патологии белка диска 1 in vitro в клетках и in vivo путем внутримозговой инокуляции или другого введения на животных моделях.

Мы уверены, что эти методы могут быть также перенесены на другие белковые агрегаты в конечном итоге с небольшими изменениями в протоколе, принятом для каждого конкретного белка. Выполняя эту процедуру, обязательно уделите время тщательному анализу изображений конфокальной микроскопии.