Высокопроизводительного скрининга для малых молекул модуляторы калиевых каналов входящего Rectifier

Общая цель данной процедуры заключается в поиске новых соединений, модулирующих активность калиевых каналов внутреннего выпрямления. Для этого сначала в 384-луночный планшет высевают клетки HEK 293 с тетрациклин-индуцибельной экспрессией интересующего KIR-канала. На втором этапе клетки нагружают флуоресцентным репортерным красителем на таллий под названием FluxIon.

Затем несвязавшийся краситель вымывают из клеток и заменяют аналитическим буфером, содержащим контрольный растворитель или исследуемые соединения. Заключительным этапом является добавление в лунки стимулирующего буфера для запуска потока таллия. В конечном итоге используется флуоресцентный планшетный ридер для выявления соединений, которые изменяют перемещение ионов таллия через канал KIR.

Основным преимуществом данного метода перед существующими методами, такими как ручная локальная фиксация мембраны (patch clamp), является возможность проведения сотен экспериментов одновременно и тысяч экспериментов ежедневно. Данный метод позволяет исследователю проводить скрининг библиотек из тысяч малых молекул для поиска модуляторов внутриклеточных выпрямляющих калиевых каналов. За день до эксперимента по определению потока таллия диссоциируйте клетки и количественно определите плотность клеточной суспензии, как описано в сопроводительной рукописи. Затем, используя среду BH, содержащую 10% диализованной FBS, высейте по 20 000 моноклональных клеток, стабильно трансфицированных геном интересующего KIR-канала, в каждую лунку 384-луночного планшета BD pure coat Amin с аминовым покрытием, используя Thermo Multi Drop Combi или многоканальный дозатор. На следующий день осмотрите планшет под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки прикрепились и равномерно распределились по дну лунок.

Затем с помощью мойки микропланшетов ELX 4 0 5 замените культуральную среду на assay-буфер HBSS в объеме 20 µL на лунку. После этого приготовьте рабочий раствор flus в 2:00 AM D, кратковременно центрифугируя пробирку для растворения 50 µg порошка flus в двух в 100 µL безводного DMSO.

Теперь добавьте к красителю 50 µL 20% (вес/объем) раствора onic F1 27 в DMSO. Перемешайте их путем осторожного пипетирования. Затем добавьте 150 µL flus в 2:00 AM onic F1 27 к 35 мл assay-буфера HBSS и осторожно перемешайте.

Затем добавьте 20 µL буфера для загрузки красителя в каждую лунку, в которой уже находится 20 µL HBSS assay.Buffer. Инкубируйте клетки при комнатной температуре примерно один час для их окрашивания красителем. Подготовьте планшет для стимуляции таллием, растворив свежеприготовленные 0,5 г бикарбоната натрия в 50 мл 5x буфера для стимуляции таллием.

Затем добавьте по 50 µL раствора в каждую лунку полипропиленгового 384-луночного планшета. После загрузки клеток флуоресцентным красителем в 2:00 утра промойте планшет с помощью мойщика микропланшетов ELX 405. Далее добавьте в каждую лунку по 20 µL или 40 µL assay-буфера HBSS; теперь планшет готов к проведению экспериментов.

Поместите планшеты с таллием и клетками в систему функционального скрининга лекарственных препаратов Hema Matsu или эквивалентный ридер для кинетической визуализации планшетов с интегрированной системой дозирования жидкостей, используя соответствующие фильтры для красителей на основе флуоресцеина, таких как flu oh four. После этого настройте протокол однократного добавления, чтобы внести 10 µL 5X серии таллия в соответствующие лунки планшета с клетками, содержащие 40 µL assay буфера HBSS. Затем зарегистрируйте базовую флуоресценцию с частотой дискретизации 1 Hz в течение как минимум 10 секунд.

После установления оптимальных условий посева клеток, промывки и загрузки флуоресценция в лунках должна быть равномерной и стабильной по всему планшету. Затем с помощью встроенного 384-канального дозатора одновременно добавьте в каждую лунку буфер со стимулятором таллия и продолжайте запись в течение как минимум двух минут, чтобы зафиксировать скорость и пик индуцированного таллием увеличения флуоресценции для последующего офлайн-анализа. В следующей серии экспериментов оцените равномерность и воспроизводимость анализа, посеяв контрольный ингибитор через одну лунку в каждом столбце и ряду 384-луночного планшета, добавив DMSO в остальные лунки в качестве контроля растворителя.

Используйте многоканальный дозатор. Подготовьте планшет с соединениями в DMSO, дозируя ингибитор целевого KIR-канала в ранее определенной концентрации (по 80 µL на лунку) и контрольный раствор 0,1% DMSO в полипропиленовый 384-луночный планшет. Для этого вносите известный ингибитор, начиная с лунки A1, затем в лунку B2 и так далее до лунки B24.

Повторите эту процедуру с DMSO, начиная с лунки B1 и так далее до лунки A24. Теперь поместите планшет с клетками, планшет с соединениями и планшет со стимулом таллия в планшетный ридер. Затем настройте протокол добавления, чтобы внести 20 µL серии соединений в 2-кратной концентрации в соответствующие лунки планшета с клетками, содержащие 20 µL аналитического буфера HBSS.

Добавьте соединения в планшет с клетками и инкубируйте их до 20 минут при комнатной температуре. Запишите базовый уровень флуоресценции в двух каналах в течение как минимум 10 секунд. Затем добавьте 10 µL пятикратного таллиевого буфера в каждую лунку планшета с клетками.

Повторите эксперимент в течение трех последующих дней для подтверждения воспроизводимости результатов. Используйте значения потока таллия в DMSO и в клетках, обработанных препаратом, для расчета значения Z-фактора (Z prime). Для статистической оценки вариабельности между лунками для двух групп лунок рассчитайте Z-фактор по следующей формуле на основе средних значений и стандартных отклонений P и N, где P — значение неингибированного потока, а N — значение полностью ингибированного потока.

Анализ со значениями ZPrime больше или равными 0.5 в течение трех отдельных дней считается подходящим для высокопроизводительного скрининга. На данных рисунках представлены примеры карт посева клеток, используемых в различных типах экспериментов. Положения лунок, содержащих неиндуцированные или индуцированные тетрациклином клетки, отмечены разными цветами.

На этом рисунке представлена карта исходного планшета, использованная для определения оптимальной концентрации таллия при разработке анализа и скрининге соединений. Цветовой градиент отображает серию трехкратных разведений в диапазоне от 100% до 0.002% таллия; приведена репрезентативная карта интенсивности флуоресценции с переходом от холодных к горячим цветам, что указывает на низкие и высокие значения потока таллия соответственно. Карта посева клеток, показанная здесь вместе с аппроксимацией кривой зависимости «концентрация-ответ» (CRC) для таллия с помощью четырехпараметрической логистической функции, используется для определения значения EEC 80, составляющего 15% таллия.

На этом рисунке представлена карта исходного планшета, используемая для определения толерантности анализа к DMSO. Столбцы 1 и 24 содержат только буфер для анализа, в то время как цветовой градиент указывает на серию двухкратных разведений в диапазоне от 10% до 0.01% DMSO; здесь приведена репрезентативная карта интенсивности флуоресценции, где низкие значения потока таллия обозначены темно-синим цветом. Здесь обобщены средние значения потока таллия, зарегистрированные в лунках с указанными концентрациями DMSO.

На данном рисунке представлена карта исходного планшета, использованного для построения кривых зависимости «концентрация — ответ» для известных ингибиторов KIR-каналов. Каждое соединение обозначено отдельным цветом и обычно наносится в виде серии трехкратных разведений. Здесь приведена репрезентативная карта интенсивности флуоресценции, демонстрирующая дозозависимое ингибирование потока таллия ингибитором после его разработки и оптимизации.

Метод анализа потока таллия также может быть использован для проведения различных рутинных фармакологических исследований. Ранее данный метод был адаптирован для работы с потенциал-зависимыми и лигандируемыми калиевыми каналами, неселективными катионными каналами и даже калиевыми транспортерами. Не забывайте, что работа с таллием может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток и надлежащая утилизация отходов.