Высокопроизводительного скрининга для малых молекул модуляторы калиевых каналов входящего Rectifier

Общая цель этой процедуры заключается в открытии новых соединений, которые модулируют активность внутренних калиевых каналов выпрямителя. Это достигается путем первого осаждения индуцируемого тетрациклина HK 2 9 3 клеток, экспрессирующих интересующий канал KIR в 384-луночный планшет. Второй шаг заключается в том, чтобы нагрузить клетки флуоресцентным таллиевым репортерным красителем под названием грипп в двух частях.

Затем невключенный краситель вымывается из клеток и заменяется буфером для анализа, содержащим контрольные или тестовые соединения. Последним этапом является добавление в лунки буфера стимула для инициирования потока таллия. В конечном счете, считыватель флуоресцентных пластин используется для идентификации соединений, которые изменяют движение ионов таллия через канал KIR. Бедный.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как ручная электрофизиология с патч-зажимом, заключается в том, что он позволяет исследователю проводить сотни экспериментов одновременно и тысячи экспериментов ежедневно. Этот метод позволяет исследователю проводить скрининг библиотек из тысяч малых молекул для обнаружения модуляторов внутренних выпрямляющих калиевых каналов. За день до эксперимента с потоком таллия диссоциировать клетки и количественно определить плотность клеточной суспензии, как описано в сопроводительной рукописи. Затем используют среду BH, содержащую 10% диализованного FBS планшета 20 000 моноклональных клеток, стабильно трансфицированных геном канала KIR, представляющим интерес, в каждой лунке 384-луночного планшета с чистым покрытием BD Amin с использованием термо мультикапельного комби или многоканального пипеттера на следующий день, осматривают планшет под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки адгезивы и равномерно распределены по дну лунок.

Затем используйте промывку для микропланшетов ELX 4 0 5 для замены среды для культивирования клеток анализом HBSS. Буфер по 20 микролитров на лунку. После этого приготовьте грипп в загрузочном растворе в 2:00 AM D, кратковременно центрифугируя пробирку, чтобы растворить 50 микрограммов гриппа в двух порошках в 100 микролитрах безводного ДМСО.

Теперь добавьте в краситель 50 микролитров 20% веса на объем. Перемешайте их с помощью пипетки. Затем добавьте 150 микролитров гриппа в 2:00 ночи от 27 до 35 миллилитров HBSS анализа, буферизируйте и аккуратно перемешайте.

Затем добавьте 20 микролитров буфера для загрузки красителей в каждую лунку, которая уже содержит 20 микролитров анализа HBSS. Буфер. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение примерно одного часа, пока клетки загружаются красителем. Приготовьте таллиевую стимулирующую пластину, растворив 0,5 грамма бикарбоната натрия в 50 миллилитрах пяти x буфера для таллиевых стимулов.

Затем добавьте по 50 микролитров раствора в каждую лунку полипропилена 384 лунки После того, как ячейки будут загружены гриппом в 2:00 ночи. Вымойте пластину с помощью шайбы для микропланшетов ELX 4 0 5. Далее добавьте 20 микролитров или 40 микролитров анализа HBSS. Буферизируйте обратно в каждую лунку, и теперь планшет готов к экспериментам.

Загрузите таллиевые и клеточные пластины в функциональную систему скрининга лекарств Hema Matsu или эквивалентный считыватель кинетических изображений планшетов со встроенными возможностями дозирования жидкости и используйте соответствующие фильтры для красителей на основе флуоресцеина, таких как flu oh four. После этого настройте протокол одиночного добавления для добавления 10 микролитров пяти серий X Thallium в соответствующие лунки клеточной пластины, содержащие 40 микролитров буфера для анализа HBSS. Затем запишите базовую флуоресценцию с частотой дискретизации в один герц в течение не менее 10 секунд.

Флуоресценция от скважины к лунке должна быть равномерной и стабильной по всему планшету после установления оптимальных условий для покрытия ячеек, промывки и d-нагрузки. В то же время используйте встроенный 384-канальный пипеттер для добавления буфера таллиевого стимула в каждую лунку одновременно и продолжайте запись в течение не менее двух минут, чтобы скорость и пик индуцированного таллием увеличения флуоресценции были зафиксированы для анализа в автономном режиме. В следующей серии экспериментов оцените однородность и воспроизводимость анализа путем введения контрольного ингибитора в каждую вторую лунку каждой колонны и ряда 384-луночного планшета и добавьте ДМСО в другие лунки в качестве средства контроля.

Используйте многоканальный дозатор. Изготовьте составную пластину ДМСО путем пипетирования ингибитора целевого канала KIR в концентрации, определенной ранее в 80 микролитров на лунку и 0,1% носителя ДМСО, в полипропиленовую пластину на 384 лунки. Это делается путем добавления известного ингибитора, начиная с лунки А 1 и чередуя ее с скважиной В 24 и так далее до скважины В 24.

Повторите эту процедуру с ДМСО, начиная с скважины В, 1 и так далее до скважины А 24. Теперь загрузите в ячейку составные и таллиевые стимульные пластины в считыватель пластин. Затем настройте протокол двух добавлений для добавления 20 микролитров двух соединений серии X в соответствующие лунки клеточной пластины, содержащей 20 микролитров буфера для анализа HBSS.

Добавьте соединения в клеточную пластину и инкубируйте их до 20 минут при комнатной температуре. Запишите исходный уровень гриппа в двух флуоресцентных условиях в течение не менее 10 секунд. Затем добавьте по 10 микролитров пяти х таллиевого буфера в каждую лунку клеточной пластины.

Повторите эксперимент в течение трех последующих дней, чтобы установить воспроизводимость результатов. Используйте поток таллия в ДМСО и обработанных лекарственными препаратами клетках для расчета значения Z-прайма. Статистическая мера изменчивости от скважины к скважине между двумя популяциями скважин вычисляет Z прайм с использованием этой формулы на основе средних значений и стандартных отклонений P и N, где P — значение неингибированного потока, а N — значение полностью ингибированного потока.

Анализ со значениями ZPrime больше или равными 0,5 в течение трех отдельных дней считается подходящим для высокопроизводительного скрининга. Эти рисунки являются некоторыми примерами карт покрытия клеток, используемых в различных типах экспериментов. Положения лунок, содержащих неиндуцированные или тетрациклиновые индуцированные клетки, обозначены разными цветами.

На этом рисунке показана карта исходной пластины, используемая для определения оптимальной концентрации таллия для разработки анализа и скрининга соединений. Цветовой градиент представляет собой трехкратный ряд разбавления в диапазоне от 100% до 0,002% таллия, и вот репрезентативная карта интенсивности флуоресценции с холодными и горячими цветами, указывающая на низкие и высокие значения потока таллия. Показанная здесь карта покрытия ячеек с подгонкой логистической функции по четырем параметрам к CRC таллия используется для определения значения EEC 80 15% таллия.

На этом рисунке показана карта исходной пластины, используемая для определения допуска ДМСО в анализе. Столбцы 1 и 24 содержат только буфер для анализа, в то время как цветовой градиент указывает на двойной ряд разведения в диапазоне от 10% до 0,01% ДМСО, а здесь представлена репрезентативная карта интенсивности флуоресценции с низкими значениями потока таллия, обозначенными более темно-синим цветом. Здесь обобщены средние значения потока таллия, зарегистрированные из скважин, содержащих указанные концентрации ДМСО.

Теперь на этом рисунке показана карта исходной пластины, используемая для построения кривых реакции на концентрацию для известных ингибиторов канала KIR. Каждое соединение обозначается разным цветом и обычно покрывается в виде тройного разведения. Здесь показана репрезентативная карта интенсивности флуоресценции, и на этом рисунке показано дозозависимое ингибитор потока таллия после его разработки и оптимизации.

Анализ таллиевого флюса также может быть использован для выполнения различных рутинных фармакологических анализов. Анализ таллиевого потока ранее был адаптирован для использования с потенциальными и лигированными калиевыми каналами, неселективными катионными каналами и даже транспортерами калия. Не забывайте, что работа с теллиумом может быть крайне опасной и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток и соответствующая утилизация отходов.