Человека нейроэндокринной опухоли клеточных линий в качестве трехмерных моделей по изучению прав нейроэндокринные опухоли терапия

Общая цель следующего эксперимента заключается в разработке простого и доступного метода получения однородных трехмерных сфероидов нейроэндокринных опухолей, а также простого метода обработки включений в HistoGel для изучения гистологии этих сфероидов. Это достигается путем равномерного нанесения аэрозоля на планшеты с 24 лунками, в которые высевают клетки нейроэндокринных опухолей человека в виде суспензии одиночных клеток. Затем планшет инкубируют в инкубаторе на орбитальном шейкере в течение ночи при скорости менее 40 RPM, после чего переносят на устойчивую полку в инкубаторе.

Сфероиды сформируются к третьему или четвертому дню; их рост и целостность контролируют с помощью фазово-контрастной микроскопии для изучения их гистологии. 3D-сфероиды заключают в подогретый HistoGel перед стандартной обработкой парафином; результаты, полученные на основании изображений, сделанных при фазово-контрастной микроскопии, демонстрируют рост 3D-сфероидов нейроэндокринной опухоли. Гистология 3D-сфероидов анализируется с помощью окрашивания гематоксилином и эозином, а также иммуногистохимического окрашивания срезов парафиновых блоков 3D-сфероидов.

Основное преимущество данной методики перед существующим методом заключается в ее простоте, доступности, надежности и экономической эффективности. Этот метод может способствовать исследованиям в области разработки лекарственных средств, помогая быстро подбирать терапевтические препараты для пациентов с нейроэндокринными опухолями. В целом, специалисты, впервые использующие данный метод, поначалу могут столкнуться с трудностями при выращивании 3D-стероидов однородной формы и размера.

Основным условием успеха является обеспечение равномерного покрытия 24-луночных планшетов агарозой, а также надлежащее диспергирование и точность дозирования суспензий единичных клеток. Для изучения гистологии 3D-органоидов необходимо провести парафинизацию и иммунохимическое окрашивание. Ключевым этапом, который будет продемонстрирован позже, является гистологическая заливка 3D-органоидов. Для приготовления 1% раствора агарозы для покрытия 24-луночных планшетов добавьте 1 г агарозы в 100 мл деионизированной воды в бутыль объемом от 250 до 500 мл и подвергните автоклавированию для стерилизации агарозы после стерилизации.

Поместите флакон в водяную баню при температуре 70 °C примерно на один час. Чтобы аэрозоль остыл до 70 °C, необходимо постоянно поддерживать его стерильность. В боксе биологической безопасности с помощью репититора дозированно внесите по 200 µL аэрозоля в каждую лунку 2 24.

Для данного протокола используйте 24-луночные планшеты с плоским дном. Подойдут любые 24-луночные планшеты с плоским дном, при условии, что они позволяют проводить визуализацию на фазово-контрастном микроскопе. Аккуратно перемешайте Matrigel в лунке круговыми движениями, чтобы он равномерно покрыл дно. Оптимальный объем Matrigel составляет 200 µL для формирования вогнутой поверхности, что обеспечивает создание сфероидов с однородной сферической формой.

Примерно через 10 минут 24-луночные планшеты, покрытые аэрозолем, будут готовы к использованию. Клетки Bon-1, используемые в данном эксперименте, представляют собой клетки нейроэндокринных опухолей (NET) поджелудочной железы человека, которые культивировали в среде D-M-E-M-F 12 с 10% FBS в стерильной чашке для культивирования тканей в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% carbon dioxide. Когда монослой клеток Bon-1 достигает 70–80% конфлюэнтности, в боксе биологической безопасности готовят суспензии из одиночных клеток.

Удалите среду и дважды промойте клетки PBS; отделите клетки от поверхности чашки, добавив 1 mL трипсина и инкубируя при 37 °C в течение пяти минут. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что все клетки открепились от чашки, после чего добавьте к трипсину 9 mL ростовой среды.

Несколько раз переместите клетки в пипетке вверх и вниз, чтобы обеспечить получение однородной суспензии одиночных клеток. Используйте клеточный фильтр с размером пор 70 мкм для фильтрации клеток. После проведения подсчета клеток соберите отфильтрованные клетки и приготовьте суспензию с концентрацией 5 000 клеток на мл в ростовой среде D-M-E-M-F 12 с 10% FBS.

Количество клеток для посева следует определить эмпирически, исходя из размера сфер на шестой день. В идеале размер сферы должен составлять от 300 до 400 мкм в диаметре. Исходя из этого, мы высеваем 1000 клеток в 200 µL на одну лунку.

Для начала данной процедуры нанесите по 200 µL суспензии одиночных клеток в каждую лунку предварительно подготовленного 24-луночного планшета с покрытием Aero; загерметизируйте планшеты стерильной герметизирующей лентой для предотвращения испарения. Поместите 24-луночные планшеты с покрытием Aero, содержащие клетки BON-1, на орбитальный шейкер при очень медленном перемешивании в увлажненный инкубатор при 37 °C с содержанием 5% CO₂ в воздухе; инкубируйте в течение ночи. На следующее утро перенесите планшеты на стабильную платформу и поддерживайте рост культур в инкубаторе каждые три дня.

Добавьте 200 µL ростовой среды в каждую лунку планшетов. Чтобы не повредить органоиды, прикоснитесь кончиком пипетки к стенке лунки и позвольте среде стечь по стенке на дно лунки; контролируйте формирование ОИД в 24-луночных планшетах под микроскопом. Лечение 3D-стероидов препаратами начинают на шестой день культивирования.

Когда диаметр сфероидов достигает примерно 300–400 мкм, этот момент обозначается как нулевой день для начала обработки препаратами на шестой день. Каждая лунка планшета содержит около 400 µL среды, чтобы обеспечить конечную концентрацию препарата 1x в каждой лунке. Для каждой дозы препарата приготовьте раствор с концентрацией в три раза выше желаемой: разведите соответствующее количество стокового раствора препарата в 5 мл ростовой среды в конической пробирке объемом 15 мл, чего достаточно для восьми повторностей. Сфероиды в каждом ряду 24-луночных планшетов характеризуются как контрольная группа (vehicle) и дозы 1, 2, 3, 4 и 5. Для каждой дозы препарата на каждом 24-луночном планшете предусмотрено четыре повторности.

Обычно 3D-сфероиды культивируют как минимум в двух 24-луночных планшетах, что обеспечивает получение не менее восьми повторностей для каждой дозы препарата. Перед введением препарата в каждую лунку планшеты центрифугируют, чтобы весь конденсат со стороны крышки стек не в лунки, так как 3D-стероиды обладают способностью к плаванию. После центрифугирования среду из лунок не удаляют.

Чтобы избежать нарушения структуры сферы, осторожно добавьте по 200 µL каждой дозы препарата в соответствующие лунки, вливая жидкость по стенке каждой из них. Герметично закройте 24-луночные планшеты специальной лентой для лунок и инкубируйте культуры в увлажненном инкубаторе при 37 °C в атмосфере воздуха с 5% carbon dioxide. Контролируйте состояние 3D-стероидных культур с помощью фазово-контрастного микроскопа в каждый выбранный временной интервал после воздействия препарата.

Объектив с пятикратным увеличением является оптимальным, поскольку при использовании десятикратного объектива PHE быстро вырастают за пределы поля зрения. Получите изображения стероидов в каждой лунке в каждой временной точке до добавления HistoGel. Для последующего заливки 3D-стероиды извлекают из 24-луночных планшетов и фиксируют в 10% Formin.

Поместите пробирку с охлажденным HistoGel в стакан с водой. Нагревайте стакан в микроволновой печи в течение одной минуты или до полного разжижения геля. Держите пробирку в этом же стакане с водой на протяжении всей процедуры.

С помощью одноразовой пластиковой пипетки перенесите весь стероид в криоформу для биопсии. Оставьте стероид на одну минуту, чтобы он осел на дно криоформы для биопсии.

Удалите жидкость из криоформы для биопсии с помощью салфеток Kim wipes. Очень осторожно переместите стероид в центр дна криоформы для биопсии, используя зубочистку. Затем с помощью пипетки Пастера очень аккуратно удерживайте стероид в центре криоформы для биопсии.

Нанесите тонкий слой подогретого HistoGel в криоформу для биопсии. Не добавляйте слишком много HistoGel; достаточно того количества, которое необходимо для стабилизации стероидов в центре.

Оставьте стероид в HistoGel на одну-две минуты при комнатной температуре или до затвердевания HistoGel. Заполните оставшееся пространство криоформы для биопсии подогретым HistoGel и дайте ему затвердеть при комнатной температуре в течение примерно 10 минут. Непосредственно перед извлечением этого блока HistoGel с OID из криоформы для биопсии.

Оставьте криоформу на льду на одну минуту, затем извлеките целый блок стероидного HistoGel. Заверните блок в кусочек биопленки и поместите его в кассету для тканей и биопсии. Храните кассету для тканей и биопсии в контейнере с 70% ethanol.

Впоследствии, при выращивании в 24-луночных планшетах с кодом aeros, выполняют стандартные процедуры обработки тканей для парафинового заливания. Различные клеточные линии нейроэндокринных опухолей (NET) демонстрируют различную морфологию, как показано здесь. Линия нейроэндокринных клеток поджелудочной железы человека BON-1 и линия нейроэндокринных клеток легкого человека H 7 27 образовали трехмерные сфероиды.

Напротив, в случае с qgp one. Клетки островков поджелудочной железы человека образуют крупные пористые массы, напоминающие виноградные гроздья, которые не расцениваются как сфероиды. После посева клеток на 24-луночный планшет, покрытый агарозой, формирование многоклеточных сфероидов обычно происходит к третьему или четвертому дню, а к шестому дню сфероиды становятся более округлыми.

Из-за ограниченного доступа питательных веществ и кислорода клетки в плотном ядре сфероида начинают погибать примерно к 10-му дню, а к 17-му дню сфероиды начинают распадаться. Благодаря большому размеру или, в некоторых случаях, выведению некротического ядра, сфероид обычно может достигать 1000 мкм в диаметре.

В данном эксперименте в качестве отправной точки для обработки ингибитором гистондеацетилазы трихостатином А (TSA) были выбраны 3D-органоиды шестого дня культивирования. Ранее было сообщано, что ингибиторы гистондеацетилазы оказывают антипролиферативное и про-апоптотическое действие на клетки нейронов. На этих изображениях отслеживается морфология 3D-органоидов в начале обработки, а также через 24, 48, 72 и 96 часов.

V означает обработку растворителем, которым в данном случае является DMSO. D1–D5 представляют обработку возрастающими дозами TSA. Размер OID каждого отдельного объекта оценивался автоматически с помощью специально разработанной компьютерной программы MATLAB.

Для каждой дозы TSA в каждой временной точке было измерено не менее восьми sph, и результаты представлены на этом графике относительно контроля (растворителя). Все дозы TSA продемонстрировали определенную степень ингибирования роста 3D OID. При концентрациях TSA 125 nano molar и 250 nano molar рост 3D стероидов был сильно подавлен для изучения гистологии чистого 3D стероида.

Окрашивание гематоксилином и эозином, а также иммуногистохимическое окрашивание были выполнены на 3D-стероиде, который культивировали в течение 17 дней. KI 67 является маркером пролиферирующих клеток, в то время как расщепленная каспаза-3 служит маркером апоптотических клеток. Результаты показывают, что клетки внешнего слоя 3D-стероида активно пролиферируют, тогда как клетки внутри ядра в основном подвержены некрозу или апоптозу.

После выполнения данной процедуры можно провести дополнительные анализы, такие как анализ CellTiter-Glo, чтобы определить жизнеспособность клеток в этих 3D-стероидах. После разработки данный метод может быть адаптирован для использования в 96-луночных планшетах для проведения высокопроизводительного скрининга, что облегчит поиск терапевтических препаратов в исследованиях рака.