Человека нейроэндокринной опухоли клеточных линий в качестве трехмерных моделей по изучению прав нейроэндокринные опухоли терапия

Общая цель следующего эксперимента заключается в разработке простого и доступного метода получения однородных трехмерных сфероидов нейроэндокринных опухолей, а также простого метода обработки включений в HistoGel для изучения гистологии этих сфероидов. Это достигается путем равномерного покрытия 24-луночных планшетов аэрозолем, на который высевают клетки нейроэндокринных опухолей человека в виде суспензии единичных клеток. Затем планшет инкубируют в инкубаторе на орбитальном шейкере в течение ночи при скорости менее 40 RPM, после чего переносят на стационарную полку инкубатора.

Сфероиды сформируются к третьему или четвертому дню; за их ростом и целостностью следят с помощью фазово-контрастной микроскопии для последующего изучения их гистологии. 3D-сфероиды заключают в подогретый HistoGel перед стандартной заливкой в парафин; результаты, полученные на основе изображений, сделанных при фазово-контрастной микроскопии, демонстрируют рост 3D-сфероидов нейроэндокринной опухоли. Гистологический анализ 3D-сфероидов проводится путем окрашивания срезов парафиновых блоков 3D-сфероидов гематоксилином и эозином, а также иммуногистохимического окрашивания.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующим методом является ее простота, доступность, надежность и экономическая эффективность. Этот метод может способствовать развитию исследований в области разработки лекарственных средств, помогая быстро идентифицировать терапевтические препараты для пациентов с нейроэндокринными опухолями. В целом, специалисты, впервые использующие этот метод, поначалу могут столкнуться с трудностями при выращивании 3D-стероидов однородной формы и размера.

Основным моментом здесь является обеспечение равномерного покрытия 24-луночных планшетов агарозой, а также уверенность в том, что суспензии одиночных клеток хорошо диспергированы и имеют точную концентрацию. Чтобы изучить гистологию 3D-органоидов, необходимо провести обработку паренхимы и иммунохимическое окрашивание. Гистологическая заливка 3D-органоидов является ключевым этапом, который будет продемонстрирован позже сегодня. Для приготовления 1% раствора агарозы для покрытия 24-луночных планшетов добавьте 1 г агарозы в 100 мл деионизированной воды в бутыли объемом от 250 до 500 мл и подвергните автоклавированию для стерилизации агарозы после завершения процесса стерилизации.

Поместите флакон в водяную баню при температуре 70 °C примерно на один час. Для охлаждения аэрозоля до 70 °C необходимо постоянно поддерживать стерильность. В боксе биологической безопасности с помощью репититора раздайте по 200 µL аэрозоля в каждую лунку 2 24.

Для данного протокола используйте планшеты с плоским дном. Подойдут любые 24-луночные планшеты с плоским дном, при условии, что они позволяют проводить визуализацию под фазово-контрастным микроскопом. Равномерно распределите Matrigel по лунке, перемещая его круговыми движениями. Для формирования вогнутой поверхности, обеспечивающей создание сфероидов правильной сферической формы, оптимальным объемом Matrigel является 200 µL.

Примерно через 10 минут 24-луночные планшеты, покрытые аэрозолем, готовы к использованию. Клетки BON-1, использованные в данном эксперименте, представляют собой клетки нейроэндокринных опухолей (NET) поджелудочной железы человека, которые культивировали в среде D-M-E-M-F 12 с 10% FBS в стерильном чашке для культивирования тканей в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2. Когда монослой клеток BON-1 достигал 70–80% конфлюэнтности, в боксе биологической безопасности готовили суспензии из отдельных клеток.

Удалите среду и дважды промойте клетки PBS; отделите клетки от чашки, добавив один миллилитр TrypLE и инкубируя при 37 °C в течение пяти минут. С помощью микроскопа убедитесь, что все клетки отделились от чашки, затем добавьте к трипсину девять миллилитров ростовой среды.

Несколько раз пропипетируйте клетки для обеспечения равномерной суспензии одиночных клеток. Используйте клеточный фильтр с размером пор 70 микрон для фильтрации клеток. После подсчета количества собранных отфильтрованных клеток приготовьте суспензию с концентрацией 5 000 клеток на миллилитр в ростовой среде D-M-E-M-F 12 с добавлением 10% FBS.

Количество клеток для посева следует определить эмпирически, исходя из размера сфер на шестой день. В идеале размер сферы должен составлять от 300 до 400 мкм в диаметре. По этой причине мы высеваем 1000 клеток в 200 µL на лунку.

Для начала данной процедуры нанесите по 200 µL суспензии одиночных клеток в каждую лунку 24-луночного планшета с покрытием Aero, подготовленного ранее; загерметизируйте планшеты стерильной уплотнительной лентой для предотвращения испарения. Поместите планшеты с покрытием Aero, содержащие клетки BON-1, на орбитальный шейкер при очень медленном перемешивании в увлажненный инкубатор при 37 °C с содержанием 5% CO2 в воздухе; инкубируйте в течение ночи. На следующее утро перенесите планшеты на стабильную платформу и продолжайте культивирование в инкубаторе. Повторяйте процедуру каждые три дня.

Добавьте по 200 µL ростовой среды в каждую лунку планшетов. Чтобы не потревожить фенотип, прикоснитесь кончиком пипетки к стенке лунки и позвольте среде стечь по стенке вниз. Контролируйте формирование ОИД в 24-луночных планшетах под микроскопом. Лечение препаратами 3D-стероидов начинают на шестой день культивирования.

Когда диаметр сфероидов достигает примерно 300–400 микрон, этот момент обозначается как нулевой день для начала обработки препаратами на шестой день. Каждая лунка планшета содержит около 400 microliters среды, чтобы обеспечить конечную концентрацию препарата 1x в каждой лунке; для каждой дозы препарата приготовьте раствор с трехкратной желаемой концентрацией, разбавив соответствующее количество стокового раствора препарата в 5 milliliters ростовой среды в конической пробирке объемом 15 milliliter, чего достаточно для восьми повторностей. PHE в каждом ряду 24-луночных планшетов характеризуются как контрольная группа (vehicle) и дозы 1, 2, 3, 4 и 5. Для каждой дозы препарата на каждом 24-луночном планшете предусмотрено четыре повторности.

Обычно 3D-сфероиды культивируют как минимум в двух 24-луночных планшетах, что обеспечивает получение не менее восьми повторностей для каждой дозы препарата. Перед добавлением препарата в каждую лунку планшеты центрифугируют, чтобы весь конденсат со стенок лунок переместился вниз, так как 3D-стероиды обладают способностью к плаванию. После центрифугирования среду из лунок не удаляют.

Чтобы избежать нарушения структуры сферы, осторожно добавьте по 200 µL каждой дозы препарата в соответствующие лунки, направляя жидкость по стенке каждой из них. Герметично закройте 24-луночные планшеты специальной лентой и инкубируйте культуры в увлажненном инкубаторе при 37 °C в атмосфере с 5% CO2. Контролируйте состояние 3D-стероидных культур в выбранные временные точки после введения препарата с помощью фазово-контрастного микроскопа.

Объектив с пятикратным увеличением является оптимальным, так как при использовании объектива с 10-кратным увеличением PHE быстро перерастают поле зрения. Снимайте изображения стероидов в каждой лунке в каждой временной точке до добавления HistoGel. Для заливки 3D-стероиды извлекают из 24-луночных планшетов и фиксируют в 10% Formin.

Поместите пробирку с охлажденным HistoGel в стакан с водой. Нагревайте стакан в микроволновой печи в течение одной минуты или до полного разжижения геля. На протяжении всей процедуры держите пробирку в этом же стакане с водой.

С помощью одноразовой пластиковой пипетки перенесите весь стероид в криоформу для биопсии. Подождите одну минуту, чтобы стероид осел на дно криоформы для биопсии.

Удалите жидкость из криоформы для биопсии с помощью салфеток Kim wipes. С помощью зубочистки очень осторожно переместите стероид в центр дна криоформы для биопсии. Затем, используя пипетку Пастера, очень аккуратно удерживайте стероид в центре криоформы для биопсии.

Добавьте тонкий слой подогретого HistoGel в криоформу для биопсии. Не добавляйте слишком много HistoGel. Достаточно того количества, которое обеспечит стабилизацию стероидов в центре.

Оставьте стероид в HistoGel на одну-две минуты при комнатной температуре или до застывания HistoGel. Заполните остальную часть криоформы для биопсии подогретым HistoGel и дайте ему застыть при комнатной температуре в течение примерно 10 минут. Непосредственно перед тем, как извлечь этот блок HistoGel с OIDs из криоформы для биопсии.

Оставьте криоформу на льду на одну минуту, затем извлеките из нее целый блок стероидного HistoGel. Оберните блок кусочком биопленки и поместите его в кассету для тканей и биопсии. Храните кассету с тканями и биопсией в контейнере с 70% ethanol.

Впоследствии, при выращивании в 24-луночных планшетах с кодировкой aeros, выполняются стандартные процедуры обработки тканей для заливки в парафин. Различные клеточные линии нейроэндокринных опухолей (NET) демонстрируют различную морфологию, как показано здесь. Линия клеток нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы человека BON-1 и линия клеток нейроэндокринной опухоли легкого человека H727 образовали трехмерные сфероиды.

Напротив, в qgp one клетки островков поджелудочной железы человека образуют крупные пористые массы, напоминающие виноградные гроздья, которые не считаются сфероидами. После посева клеток на 24-луночный планшет, покрытый агрозом, формирование многоклеточных сфероидов обычно происходит к третьему или четвертому дню, а к шестому дню сфероиды становятся более округлыми.

Из-за ограничения в питательных веществах и кислороде клетки в плотном ядре сфероида начинают погибать примерно к 10-му дню, а к 17-му дню сфероиды начинают распадаться. Благодаря большому размеру или, в некоторых случаях, выталкиванию некротического ядра, сфероид обычно может достигать 1000 микрон в диаметре.

В данном эксперименте в качестве отправной точки для обработки ингибитором гистондеацетилазы трихостатином А (TSA) были выбраны 3D-органоиды шестого дня культивирования. Ранее было сообщено, что ингибиторы гистондеацетилаз оказывают антипролиферативный и проапоптотический эффекты на клетки нейромышечного аппарата. На этих изображениях прослежена морфология 3D-органоидов в начале обработки, а также через 24, 48, 72 и 96 часов.

V указывает на обработку растворителем, которым в данном случае является DMSO. D1–D5 представляют обработку возрастающими дозами TSA. Размер OID каждого отдельного образца оценивался автоматически с помощью специально разработанной компьютерной программы MATLAB.

Для каждой дозы TSA в каждой временной точке было измерено не менее восьми sph; результаты представлены на данном графике относительно контроля (растворителя). Все дозы TSA продемонстрировали определенную степень ингибирования роста 3D OID. При концентрациях TSA 125 nano molar и 250 nano molar рост 3D стероидов был сильно подавлен, что позволило изучить гистологию итогового 3D стероида.

Окрашивание гематоксилином и эозином, а также иммуногистохимическое окрашивание были выполнены на 3D-органоидах, которые культивировались в течение 17 дней. KI 67 является маркером пролиферирующих клеток, в то время как расщепленная каспаза-3 служит маркером апоптотических клеток. Результаты показывают, что клетки внешнего слоя 3D-органоидов активно пролиферируют, тогда как клетки в ядре в основном подвержены некрозу или апоптозу.

После выполнения данной процедуры можно провести дополнительные анализы, такие как тест CellTiter-Glo, для определения жизнеспособности клеток в этих 3D-стероидах. После доработки данный метод может быть адаптирован для использования в 96-луночных планшетах для проведения высокопроизводительного скрининга, что будет способствовать поиску терапевтических препаратов в исследованиях рака.