Субстрат поколения для эндонуклеаз CRISPR / Cas системы

Общая цель следующих экспериментов заключается в получении РНК-субстратов для изучения Cas-эндонуклеазы, которая играет ключевую роль в иммунных системах CRISPR-Cas бактерий и архей, чтобы получить РНК-субстраты для Cas-эндонуклеазы. Для получения длинной ДНК-матрицы для синтеза РНК in vitro при необходимости можно использовать ПЦР-амплификацию специфического региона CRISPR.

Два олигонуклеотида могут быть отжёжены для создания более коротких матриц для продукции субстратной РНК. В качестве альтернативы, короткие синтезированные на заказ повторяющиеся последовательности могут быть протестированы в анализах с использованием эндонуклеазы CAS. В конечном итоге продукция РНК-транскриптов и их последующее расщепление эндонуклеазой CAS6 могут быть визуализированы с помощью авторадиографии.

Основная цель представленных методов заключается в том, чтобы дать исследователям возможность изучать процессинг CRISPR-РНК с использованием РНК-субстратов различной длины. Таким образом, для генерации малых РНК, например, одиночных повторяющихся элементов, или более крупных РНК, таких как транскрипты crispr-РНК, охватывающие несколько спейсеров, используются различные подходы. Хотя эти методы позволяют получить конкретные сведения о созревании CRISPR-РНК, аналогичные стратегии подготовки шаблонов могут быть применены и для других систем процессинга РНК. Процедуру будут демонстрировать аспирант и постдок из лаборатории по изучению бактериальных и археальных CRISPR-иммунных систем.

Вирусная последовательность ДНК, называемая протоспейсером, может быть встроена между двумя повторяющимися элементами в растущем CRISPR-кластере в процессе, называемом адаптацией. Затем весь CRISPR-кластер транскрибируется и расщепляется на короткие CRISPR-РНК эндонуклеазой Cas, например, Cas6. Эти короткие CRISPR-РНК затем включаются в белковый комплекс Cascade и обеспечивают защиту хозяина при повторном вирусном нападении, используя комплементарность оснований между CRISPR-РНК и протоспейсером в качестве сигнала для деградации вирусной ДНК с целью генерации длинных субстратов пре-CRISPR-РНК.

Начните с разработки праймеров для ПЦР, нацеленных на спейсерные области кластера CRISPR, добавив последовательность промотора Т7-РНК-полимеразы к прямому праймеру. Затем добавьте сайты рестрикции к обоим праймерам для клонирования ПЦР-продукта в вектор. Обратите внимание, что Т7-РНК-полимеразе требуется остаток гуанина для правильной инициации транскрипции после амплификации интересующей последовательности пре-CRISPR РНК из геномной ДНК с помощью ПЦР.

Разделите продукты ПЦР с помощью гель-электрофореза в агарозном геле и вырежьте нужную полосу, затем обработайте продукт ПЦР рестрикционными ферментами для создания липких концов. Далее, после очистки продукта ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР-продуктов для удаления любых побочных продуктов расщепления, добавьте T4 ДНК-лигазу, буфер T4 ДНК-лигазы и расщепленный продукт ПЦР с соответствующими липкими концами в молярном соотношении 3:1 к вектору pUC с соответствующими липкими концами. Инкубируйте реакцию лигирования при 16 °C в течение ночи, а затем трансформируйте смесь в компетентные клетки E. coli DH5α согласно стандартным протоколам, используя сине-белый скрининг для идентификации успешной лигации.

Наконец, выделите плазмиды из белых колоний с помощью набора для выделения плазмид и идентифицируйте положительные клоны путем секвенирования плазмид для получения субстратов предшественника CRISPR-РНК промежуточного размера. Начните с разработки прямых и обратных олигонуклеотидов с желаемой последовательностью спейсеров CRISPR, аналогичной последовательностям, показанным здесь. Обратите внимание, что олигонуклеотиды содержат последовательность промотора T7 РНК-полимеразы, а также терминальные сайты рестрикции в конце олигонуклеотидов для обеспечения образования липких концов.

После перемешивания инкубируйте образцы с Т4-полинуклеотидкиназой и буфером для Т4-полинуклеотидкиназы в течение одного часа при 37 °C для 5'-фосфорилирования 1 нмоль каждого из олигонуклеотидов. Затем инкубируйте фосфорилированные прямые и обратные олигонуклеотиды с буфером для Т4-ДНК-лигазы в течение пяти минут при 95 °C на нагревательном блоке. После гибридизации образцов выключите источник тепла и дайте смеси остыть в течение примерно двух-трех часов до достижения комнатной температуры.

Теперь лигируйте полученные олигонуклеотиды с гибридизационной смесью переваренного и дефосфорилированного вектора P с использованием T4 DNA Ligase buffer и ATP при 16 °C в течение ночи. Затем трансформируйте лигированные плазмиды в компетентные клетки e coli DH5α по стандартным протоколам, используя сине-белый скрининг для идентификации успешной лигирования. Наконец, выделите плазмиды и идентифицируйте положительные клоны с помощью рестрикции и последующего секвенирования плазмид.

Короткие последовательности РНК-субстратов cas с одним повтором можно разработать по аналогии с представленными здесь. Обязательно включите дезоксирибонуклеотид. Если необходимо определить сайт расщепления РНК, для синтеза олигонуклеотида РНК можно воспользоваться услугами специализированного центра синтеза.

После выделения плазмид с выбранным специализированным субстратом линеаризуйте плазмиды с помощью рестрикционного фермента, который расщепляет последовательность ниже клонированных фрагментов, используя набор для очистки плазмид методом макси-препа. После подтверждения полного переваривания очистите линеаризованную плазмиду методом фенол-хлороформной экстракции и осаждения этанолом. Восстановите нуклеиновые кислоты, ресуспендируя осадок в стерильной воде, обработанной DEPC.

Теперь инкубируйте digested плазмиды в свежеприготовленной смеси для runoff-транскрипции in vitro с использованием Т7 РНК-полимеразы, содержащей ATP, CTP, GTP и UTP, в течение трех часов при 37 °C. В завершение проанализируйте полученные РНК-транскрипты на денатурирующем 8 M мочевинном 12%-полиакриламидном геле. Также возможно очистить транскрипты с помощью моно-Q анионообменной хроматографии, после чего выделить транскрипты путем осаждения РНК-фракций этанолом и ресуспендирования осадка в стерильной воде, обработанной DEPC, для анализа сконструированных субстратов с помощью тестов с эндонуклеазами; начните с визуализации полос субстрата с помощью авторадиографии и очистки продуктов реакции методом гель-экстракции из 8 M мочевинного денатурирующего геля.

Для этого используют 12%-й полиакриламидный гель, затем синтезируют и очищают нужные рекомбинантные белки Cas методом теплового осаждения и никелевой NTA-хроматографии, как показано на примере белка Cas6 из Clostridium thermocellum. Затем смешивают белок Cas со свежеприготовленной реакционной смесью для эндонуклеазы на 30 минут при 37 °C для проведения анализа эндонуклеазной активности. В завершение 5 мкл реакционной смеси наносят на 8 M раствор мочевины.

12% полиакриламидный гель и визуализация продуктов расщепления после электрофореза с помощью авторадиографии. Здесь представлен окрашенный Coomassie blue полиакриламидный гель с кастомным РНК-олигонуклеотидом и двумя РНК-транскриптами, полученными in vitro. Обратите внимание, что эффективность синтеза РНК различается для коротких, длинных и конструкций промежуточной длины.

Исследование эндонуклеазной активности РНК требует наличия положительного и отрицательного контролей, а также высокоочищенных рекомбинантных белков Cas. На данном рисунке представлен электрофорез в ПААГ с SDS образца подготовки Cas6 из Clostridium thermocellum.

Представлен результат никель-NTA-хроматографии после теплового осаждения, проведенной совместно со стандартным белковым маркером. Соответствующий образец отрицательного контроля должен содержать клеточный лизат без экспрессии CAS six, однако после прохождения идентичной процедуры очистки CAS six было установлено, что препарат CAS six обладает требуемым высоким уровнем чистоты. Здесь с помощью авторадиографии можно визуализировать расщепление субстрата с меченой 5'-терминальной повторяющейся последовательностью белком CAS six из co Clostridium thermo cell.

В каждой дорожке содержится радиоактивно меченный субстрат: РНК после инкубации с белком ca six, что отмечено знаками «плюс», или с буфером в качестве отрицательного контроля, что отмечено знаками «минус»; длинные или короткие субстраты с добавлением или без добавления дезоксирибонуклеотида в положении минус девять, который использовался для облегчения реакции эндонуклеазы. Обратите внимание на отсутствие расщепления коротких субстратов при включении дезоксирибонуклеотида в молекулу РНК после выполнения данной процедуры.

Нуклеазы Cas6 также могут использоваться в качестве инструмента для получения зрелых, четко очерченных РНК. Эти РНК могут быть включены в комплексы Cascade для изучения их роли в интерференции при вирусных атаках. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как проектировать и производить CRISPR-субстраты для нуклеаз Cas.

Эти различные субстраты полезны для решения вопросов, касающихся созревания и использования crispr Es.