Субретинальной инъекция генной терапии векторы и стволовых клеток в мышь глаз
25 ноября 2012 г.
Этот хирургический метод иллюстрирует введение генной терапии векторы и стволовых клеток в субретинальной пространство мыши глаз.
Первым шагом является сборка устройства из набора для забора крови. Отрежьте иглу калибра 25 ¾ от этого восьмисантиметрового отрезка стерильной трубки. С помощью луэровского замка можно использовать стеклянную капиллярную иглу диаметром 100 мкм, которую можно приобрести или изготовить самостоятельно на вытягивателе пипеток Sutter P 97, затем аспирируйте стерильный физиологический раствор, чтобы заполнить мертвое пространство в трубке.
Прикрепите стеклянную капиллярную трубку к концу стерильной пластиковой трубки; выдавите немного физиологического раствора через иглу, чтобы убедиться в правильности крепления и отсутствии утечек. При рассмотрении под микроскопом можно оценить прикладываемое давление и скорость выталкивания жидкости через тонкий кончик; для имитации вирусного вектора или стволовых клеток мы будем использовать окрашенный раствор. Поместите трубку в стерильную чашку Петри, аспирируйте немного воздуха, а затем раствор для инъекции.
Для наших целей мы используем мышей линии P5. На этом изображении виден нос. Область глаза закрыта верхним веком.
Пунктирные линии обозначают край века и складку века, где будет сделан разрез. С помощью прямых ножниц Ваниса выполняется разрез длиной 1,5 mm вдоль закрытого века. Щипцы для расширения глазной щели используются для разведения век и доступа к глазу, при этом край века должен находиться чуть позади глазного яблока.
Для выполнения склеротомии важно уметь определять несколько ориентиров. Переход от прозрачной роговицы к склере отмечен лимбом. Сразу за склерой находится ретинальный пигментный эпителий, затем сетчатка и далее стекловидное тело. Витректомия проводится на halfway back или на экваторе глазного яблока; разрез выполняется путем надрезания поверхности 15-градусным микрохирургическим лезвием у темнопигментированных животных.
В месте разреза станет видна темно-коричневая пигментированная ткань. Если сделать разрез слишком глубоким, вы увидите вытекающую жидкость. Это стекловидное тело, что означает, что вы зашли слишком далеко.
Прохождение через ретинальный пигментный эпителий (РПЭ) сетчатки. Данный разрез может быть использован для интравитреальной инъекции. Теперь перейдем к подготовке собственного животного.
На данном этапе разрез завершен. Дополнительный разрез и микронадрезы приведут к вытеканию стекловидного тела для проведения субретинальной инъекции; целью является введение микрокапиллярной стеклянной трубки в субретинальное пространство, непосредственно между сетчаткой и РПЭ. Если разрез был слишком глубоким, игла может пройти сквозь сетчатку в стекловидное тело. Введите иглу параллельно внешней стенке глаза.
Для введения в субретинальное пространство слегка нажмите на поршень и начните инъекцию жидкости. При правильном расположении иглы будет ощущаться умеренное обратное давление, и в субретинальном пространстве образуется BLE.
Если игла находится в стекловидном теле, обратное давление будет значительно ниже. Чтобы избежать выраженного рефлюкса, удерживайте плунжер в фиксированном положении еще в течение 15 секунд перед извлечением иглы. Это позволит внутриглазному давлению стабилизироваться.
Осторожно задвиньте глаз за веки в орбиту с помощью изогнутого хирургического пинцета. Вот еще один пример субретинальной инъекции, при которой краситель заполняет субретинальное пространство и четко виден у альбиноса. Воздушный мениск позволяет определить момент окончания инъекции.
Инъекции жидкостей в глаз с темной пигментацией представляют собой несколько более сложную задачу. Тщательное введение иглы позволит достичь отличных результатов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Эта хирургические техника иллюстрирует введение генов-терапевтических векторов и стволовых клеток в подсетчатку глаза мыши. Процесс включает в себя тщательную сборку устройства для точной доставки лечебных агентов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Геновые терапии
- Исследование стволовых клеток
- Офтальмология
Предпосылки
- Геновые терапии направлены на лечение или предотвращение болезней путем введения генетического материала в клетки.
- Стовловые клетки обладают потенциалом для регенерации поврежденных тканей.
- Подсетчатное пространство является критической областью для окулярных вмешательств.
- Мышь-модель часто используется для предклинических исследований в области исследования зрения.
Цель исследования
- Продемонстрировать хирургические технику для доставки генов-терапевтических векторов.
- Исследовать потенциал стволовых клеток в лечении заболеваний сетчатки.
- Усовершенствовать методы для точных инъекций в глаз.
Используемые методы
- Сборка устройства из набора для венепункции.
- Подготовка стеклянной капиллярной иглы для инъекции.
- Аспирация стерильного физиологического раствора для заполнения устройства.
- Использование окрашенного раствора для представления вирусного вектора или стволовых клеток в процессе.
Основные результаты
- Устройство позволяет контролировать инъекцию в подсетчатное пространство.
- Успешное визуализирование выброса жидкости под микроскопом.
- Демонстрация возможности техники для генов-терапевтических применений.
- Потенциальные последствия для будущих лечений заболеваний сетчатки.
Заключения
- Эта техника предоставляет надежный метод доставки генов-терапии.
- Необходимы дополнительные исследования для оценки долгосрочных результатов.
- Это открывает пути для инновационных методов лечения ретинальных расстройств.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This surgical technique enables precise delivery of gene therapy vectors and stem cells to the subretinal space in perinatal mouse eyes, supporting preclinical validation of ocular therapeutics. By minimizing tissue damage and ensuring accurate targeting, the method enhances reproducibility in early-stage discovery workflows for retinal disease models. It provides a scalable platform for evaluating therapeutic candidates before advancing to larger animal studies or IND-enabling research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of gene therapy constructs in a disease-relevant ocular microenvironment.
- Operational Value: Supports target validation by confirming delivery to the intended retinal cell layers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable readouts of vector or cell distribution via visualized bleb formation in the subretinal space.
- Operational Value: Standardizes injection parameters for reproducible compound or cell dosing across study cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by allowing longitudinal assessment of engraftment or expression in perinatal models.
- Operational Value: Enables dose-response testing critical for preclinical safety and efficacy profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for ocular gene and cell therapies.
- Discovery Biology: Tests hypotheses regarding vector tropism, promoter activity, or stem cell engraftment in the retinal niche.
- Screening: Delivers standardized volumes of therapeutic agents to enable comparative screening of candidates.
- Analytics: Provides visual and spatial readouts (e.g., bleb size, fluorescence) to quantify delivery success.
- Translational Research: Bridges discovery to preclinical studies by validating delivery in a physiologically relevant neonatal eye model.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable surgical platform for iterative testing of multiple vectors or cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target engagement by confirming subcellular localization of delivered agents.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized device assembly and injection technique.
- Strategic Value: Reduces biological de-risking delays by enabling early functional validation in vivo.
- Portfolio Impact: Supports go/no-go decisions based on delivery efficiency and tissue integrity metrics.
Implementation Considerations
- Requires microsurgical expertise and familiarity with neonatal ocular anatomy.
- Dependent on precision instrumentation including microsurgical blades, forceps, and glass capillary preparation tools.
- Necessitates standardized training to minimize variability in incision depth and needle placement across operators.
- Must account for pigmentation-dependent visualization challenges when adapting to different mouse strains.
- Limited by the technical skill required to avoid vitreous penetration and ensure subretinal placement.
