Анализ SNARE-опосредованного слияния мембран помощью ферментативного анализа слияния клеток

Общая цель данной процедуры заключается в количественном определении событий слияния клеток, опосредованных белками SNARE, путем активированной экспрессии бета-галактозидазы. Это достигается путем предварительной эктопической экспрессии v- и t-SNARE белков на поверхности клеток COST7. Следующим этапом процедуры является объединение клеток, экспрессирующих v-SNARE белки, с клетками, экспрессирующими t-SNARE белки.

Это приводит к опосредованному белками SNARE слиянию клеток и активации экспрессии бета-галактозидазы. В конечном итоге активность бета-галактозидазы, индуцированная слиянием клеток, измеряется с помощью спектрофотометра. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими методами, такими как микроскопический анализ областей SAL, является возможность анализа нескольких комбинаций SNARE.

С количественной точки зрения, этот метод может быть применен для изучения механизмов и регуляции слияния мембран, опосредованного белками SNARE. Он также может быть использован для проведения высокопроизводительных исследований. Процедуру продемонстрируют Док На Хассан, постдок, и Дэвид Хамфри, техник из моей лаборатории, за день до загрузки трансфекции.

Подготовьте 24-луночные планшеты со стеклянными покровными стеклами диаметром 12 мм, выделив по две лунки для каждой комбинации клеток, экспрессирующих уникальные плазмиды в эксперименте, на этих стеклах. Посейте 30 000 клеток COST7, культивируемых в среде DMEM с добавлением 4,5 г/л глюкозы и 10% FBS, для последующей трансфекции. В каждую лунку добавьте 0,25 мкг плазмиды TTA и один набор экспрессионных плазмид.

Для трансфекции T-клеток белками интереса (в данном случае — «перевернутыми» vamps) добавьте 0,25 µg плазмиды, кодирующей TRE lacks Z, и комплементарный набор плазмид, кодирующих белки интереса: snap 25, syntaxin 1 и syntaxin 4. Проведите трансфекцию клеток COST7 с помощью липофектамина согласно инструкциям производителя и культивируйте клетки в течение 24 часов. Через 24 часа после трансфекции зафиксируйте клетки в дополненном параформальдегиде в течение 10 минут. После фиксации промойте клетки трижды раствором PBS++, затем заблокируйте клетки с использованием дополненной FBS в течение 30 минут.

После блокировки инкубируйте клетки с моноклональными антителами anti-mic Nine E 10 в течение 30 минут; затем, после четырех промывок в PBS++, инкубируйте клетки в течение одного часа с вторичными антителами, конъюгированными с фикоэритрином, в разведении 1:500. После еще четырех промывок в PBS++ заключите меченые клетки в коммерчески доступный антифейдинговый реагент.

Клетки готовы к конфокальной микроскопии. За день до трансфекции высейте 1,2 миллиона клеток в каждую 100-миллиметровую чашку для культивирования тканей и 200 000 клеток в каждую лунку 6-луночных планшетов для каждой анализируемой комбинации плазмид. Культивируйте клетки в течение 24 часов. На следующий день добавьте плазмиды для трансфекции. Для клеток V трансфицируйте в каждую 100-миллиметровую культуру плазмиду, экспрессирующую интересующий белок с Flippase, и 5 µg ptet-off.

Проведите ко-трансфекцию контрольных клеток в культуральной чашке диаметром 100 мм пустым вектором и P te off в тех же относительных концентрациях, что и в клетках V. После добавления всех плазмид в клетки V и контрольные клетки, добавьте в эти лунки tcom mycin, чтобы предотвратить N-гликозилирование vamps. В каждой лунке шестилуночных планшетов проведите ко-трансфекцию T-клеток одной микрограммом PBIG с комплементарными плазмидами, экспрессирующими интересующие белки.

Теперь проведите трансфекцию клеток COST7 с помощью липосом в соответствии с инструкциями производителя. Затем культивируйте клетки в течение 24 часов; по истечении 24 часов после трансфекции отделите клетки V от чашек для культивирования, используя буфер для диссоциации клеток без ферментов. Начните с однократной промывки клеток 20 миллилитрами PBS.

Затем добавьте 5 mL безферментного буфера для диссоциации. После 10 минут инкубации при комнатной температуре клетки отделятся при резком постукивании по планшету; проверьте факт их открепления под микроскопом. Если отделилось менее половины клеток, подождите еще пять минут и снова постучите по планшету.

Продолжайте инкубацию в буфере для открепления до тех пор, пока открепятся более половины клеток. Затем подсчитайте количество клеток V с помощью гемоцитометра. После этого ресуспендируйте клетки V до концентрации приблизительно 480 000 клеток на миллилитр в дополненном буфере Хенкса DMEM.

Теперь добавьте по 1 мл ресуспендированных V-клеток в каждую лунку с Т-клетками и верните планшеты в инкубатор. После 6, 12 или 24 часов совместного культивирования клеток промойте их PBS и добавьте лизирующий буфер. Затем снимите клетки со дна лунок скребком и перенесите их в пробирки для центрифугирования.

После центрифугирования перенесите супернатант в новую пробирку и измерьте экспрессию бета-галактозидазы с помощью имеющегося в продаже набора реагентов в соответствии с инструкциями производителя. В ходе данного протокола обязательно остановите холеретрическую реакцию через 90 минут, добавив 1 M карбоната натрия для оценки результатов. Измерьте оптическую плотность при 420 нм на спектрофотометре. При трансфекции клеток CO7 плазмидами flipped snare на поверхности клеток экспрессировались белки flipped snare.

Для измерения уровней экспрессии белков SNARE на поверхности клеток использовали проточную цитометрию. Чтобы сравнить их способность к слиянию мембран, необходимо было обеспечить одинаковый уровень экспрессии VAMPs. Поэтому концентрация каждой плазмиды с инвертированным белком SNARE, использованной при трансфекции, была титрована и оптимизирована.

В таких условиях vamps 1, 3, 4, 5, 7 и eight, а также syntaxin one и four экспрессировались на поверхности клеток на одинаковом уровне соответственно; для проверки применимости данного анализа были использованы нейрональные белки SNARE, опосредующие синаптический экзоцитоз. Действительно, при объединении V-клеток, экспрессирующих vamp two, и T-клеток, экспрессирующих SYNTAXIN one и snap 25, была обнаружена интенсивная экспрессия бета-галактозидазы. Однако при отсутствии экспрессии либо vamp two, либо SNAP 25 обнаруживалась только базовая активность бета-галактозидазы, что указывает на то, что слияние клеток и экспрессия бета-галактозидазы зависят от взаимодействий v- и t-SNARE; в целом SYNTAXIN one, snap 25, vamp one, vamp three и vamp eight обладали сопоставимой и наиболее высокой способностью к слиянию.

Напротив, базовый уровень активности бета-GAL указывает на то, что данная комбинация белков не стимулирует слияние мембран, в отличие от случая с vamp five и SYNTAXIN one. Snap 25. При проведении ферментативного анализа слияния важно не забыть добавить туникамицин для предотвращения N-гликозилирования белков SNARE и добавить DTT для предотвращения образования дисульфидных связей между белками SNARE.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить анализ слияния клеток.