Анализ SNARE-опосредованного слияния мембран помощью ферментативного анализа слияния клеток

Общая цель данной процедуры — количественно определить события слияния клеток, опосредованные белками SNARE, по активированной экспрессии бета-галактозидазы. Для этого сначала проводят эктопическую экспрессию v- и t-SNARE белков на поверхности клеток COST7. Следующим этапом процедуры является объединение клеток, экспрессирующих v-SNARE белки, с клетками, экспрессирующими t-SNARE белки.

Это приводит к опосредованному белками SNARE слиянию клеток и активации экспрессии бета-галактозидазы. В конечном итоге активность бета-галактозидазы, индуцированная слиянием клеток, измеряют с помощью спектрофотометра. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как микроскопический анализ области SAL, является возможность анализа множества комбинаций белков SNARE.

С количественной точки зрения, данный метод может быть использован для изучения механизмов и регуляции слияния мембран, опосредованного белками SNARE. Он также может быть применен для проведения высокопроизводительных исследований. Процедуру продемонстрируют Док На Хассан, постдок, и Дэвид Хамфри, техник моей лаборатории, за день до загрузки для трансфекции.

Подготовьте 24-луночные планшеты со стеклянными покровными стеклами диаметром 12 миллиметров, выделив по две лунки для каждой комбинации клеток, экспрессирующих уникальные плазмиды в эксперименте, на этих стеклах. Для трансфекции посейте 30 000 клеток COST-7, культивируемых в среде DMEM с добавлением 4,5 г/л глюкозы и 10% FBS. В каждую лунку добавьте 0,25 мкг плазмиды TTA и один набор экспрессионных плазмид.

Для трансфекции T-клеток белками интереса (в данном случае — flipped vamps) добавьте 0,25 µg плазмиды, кодирующей TRE lacks Z, и комплементарный набор плазмид, кодирующих белки интереса: snap 25, syntaxin 1 и syntaxin 4. Проведите трансфекцию клеток cost 7 с помощью липофектамина согласно инструкциям производителя и культивируйте клетки в течение 24 часов. Через 24 часа после трансфекции зафиксируйте клетки в дополненном параформальдегиде в течение 10 минут. После фиксации трижды промойте клетки раствором PBS++, затем заблокируйте клетки с помощью дополненного FBS в течение 30 минут.

После блокировки инкубируйте клетки с моноклональными антителами anti mic Nine E 10 в течение 30 минут. После четырех промывок раствором PBS++ инкубируйте клетки в течение одного часа с вторичными антителами, конъюгированными с фикоэритрином, в разведении 1:500. После еще четырех промывок раствором PBS++ закройте помеченные клетки с использованием имеющегося в продаже реагента против выцветания.

Клетки готовы к конфокальной микроскопии. За день до трансфекции высейте 1,2 миллиона клеток в каждую 100-миллиметровую чашку для культивирования тканей и по 200 000 клеток в каждую лунку 6-луночных планшетов для каждой анализируемой комбинации плазмид. Культивируйте клетки в течение 24 часов. На следующий день добавьте плазмиды для трансфекции: для V-клеток трансфицируйте клетки в каждой 100-миллиметровой культуре плазмидой, экспрессирующей целевой белок с FLIP-меткой, и 5 мкг pTet-Off.

Котрансфектируйте контрольные клетки в 100-миллиметровой культуральной чашке с помощью пустого вектора и P te off в тех же относительных концентрациях, что и в клетках V. После добавления всех плазмид в клетки V и контрольные клетки, добавьте tcom mycin в эти лунки, чтобы предотвратить N-гликозилирование vamps. В каждой лунке шестилуночных планшетов котрансфектируйте T-клетки 1 µg PBIG с комплементарными плазмидами, экспрессирующими интересующие белки.

Теперь проведите трансфекцию клеток COST7 с помощью Lipofectamine согласно инструкциям производителя. Затем культивируйте клетки в течение 24 часов. Через 24 часа после трансфекции отделите клетки от чашек для культивирования, используя буфер для диссоциации клеток без содержания ферментов. Начните с однократной промывки клеток 20 мл PBS.

Затем добавьте 5 мл буфера для диссоциации без ферментов. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре клетки отделятся при резком постукивании по планшету; проверьте под микроскопом, открепились ли они. Если отделилось менее половины клеток, подождите еще пять минут и снова постучите по планшету.

Продолжайте инкубацию в буфере для отсоединения до тех пор, пока не отсоединится более половины клеток. Затем подсчитайте количество клеток V с помощью гемоцитометра. После этого ресуспендируйте клетки V до концентрации примерно 480 000 клеток на миллилитр в дополненном буфере Хенкса DMEM.

Теперь добавьте по 1 мл ресуспендированных клеток V в каждую лунку с Т-клетками и верните планшеты в инкубатор. После 6, 12 или 24 часов совместного культивирования клеток промойте их раствором PBS и добавьте лизирующий буфер. Затем снимите клетки с поверхности лунок с помощью скребка и перенесите их в пробирки для центрифугирования.

После центрифугирования перенесите супернатант в новую пробирку и измерьте экспрессию бета-галактозидазы с помощью имеющегося в продаже набора для анализа согласно инструкциям производителя; в ходе данного протокола обязательно остановите колориметрическую реакцию через 90 минут, добавив одномолярный раствор карбоната натрия для оценки результатов. Измерьте абсорбцию при 420 нанометрах на спектрофотометре. При трансфекции клеток CO7 плазмидами flipped snare на поверхности клеток экспрессировались белки flipped snare.

Для измерения уровней экспрессии белков SNARE на поверхности клеток использовали проточную цитометрию. Для сравнения их способности к слиянию мембран требовалось обеспечить одинаковый уровень экспрессии белков VAMP. Поэтому концентрация каждой плазмиды «flipped snare», использованной при трансфекции, была титрована и оптимизирована.

В таких условиях vamps 1, 3, 4, 5, 7 и 8, а также syntaxin 1 и 4 экспрессировались на поверхности клеток на одинаковом уровне соответственно; для проверки возможности проведения анализа были использованы нейрональные белки SNARE, которые опосредуют синаптический экзоцитоз. Действительно, при объединении V-клеток, экспрессирующих vamp 2, и T-клеток, экспрессирующих SYNTAXIN 1 и snap 25, была обнаружена выраженная экспрессия бета-галактозидазы. Однако при отсутствии экспрессии vamp 2 или SNAP 25 обнаруживалась только базовая активность бета-галактозидазы, что указывает на то, что слияние клеток и экспрессия бета-галактозидазы зависят от взаимодействий v- и t-SNARE; в целом SYNTAXIN 1, snap 25, vamp 1, vamp 3 и vamp 8 обладали сопоставимой и самой высокой способностью к слиянию.

Напротив, фоновая активность бета-GAL указывает на то, что данная комбинация белков не стимулирует слияние мембран, в отличие от случая с vamp five и SYNTAXIN one. Snap 25. При проведении ферментативного анализа слияния важно не забывать добавлять туникамицин для предотвращения N-гликозилирования белков SNARE и DTT для предотвращения образования дисульфидных связей между белками SNARE.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить анализ слияния клеток.