Целевые маркировки нейронов в конкретных функциональных микро-области коры головного мозга путем объединения Внутренняя сигнала и Двухфотонные изображений

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы точно нацелиться на микродомены в функциональной карте для изучения структуры и функций нейронов с высоким разрешением. Это достигается путем предварительного выполнения визуализации собственного сигнала на большой площади коры головного мозга для получения карты интересующего стимульного объекта. Вторым шагом является определение точного местоположения на карте, которое должно быть выбрано для фотонной визуализации с высоким разрешением.

Далее, после тщательного позиционирования пипетки, загруженной флуоресцентным красителем, нейроны маркируются флуоресцентным маркером. Наконец, собираются фотонные изображения нейронных реакций или структур с высоким разрешением. В конечном счете, карта признаков собственного сигнала может быть использована для поиска интересующей области, такой как ориентационная сингулярность вертушки, которая затем может быть нацелена на изучение с разрешением одного нейрона.

Основное преимущество этого протокола заключается в том, что с помощью одного и того же микроскопа можно получить изображение коры головного мозга в разных пространственных масштабах с помощью всего нескольких быстрых настроек системы. Это позволяет комбинировать эти методы для использования карты собственных сигналов с разрешением курса в качестве руководства для выбора области нейронов для маркировки флуоресцентными зондами для визуализации с высоким разрешением. Животное было обезболировано в соответствии с протоколом, утвержденным комитетом по уходу за животными, а череп был обнажен и очищен.

Стоматологическая цементная смесь была использована для крепления головной пластины из нержавеющей стали с прямоугольным отверстием в центре к черепу. Металлическая камера в верхней части головной пластины служит резервуаром для получения изображений с помощью линзы объектива погружения в воду. Оголовочная пластина была закреплена на двухкоординатной ступени с помощью металлических стоек.

Используйте бормашину, чтобы истончить большую область кости в прямоугольном отверстии пластины головки. Нанесение костного воска необходимо для остановки периодических кровотечений. Тонкий участок должен выходить за границы планируемой трепанации черепа.

Затем просверлите квадратный контур два на два миллиметра в кости для трепанации черепа. Периодически промывайте камеру свежей искусственной спинномозговой жидкостью, чтобы удалить осколки костей и свести к минимуму рассеивание тепла к нижележащей коре. Теперь поднимите кость с помощью щипцов номер три.

С помощью щипцов номер пять и пружинных ножниц Vana удалите верхние слои твердой мозговой оболочки, оставив нижний слой нетронутым. Последний слой твердой мозговой оболочки прозрачный и через него должны быть хорошо видны отслаивающиеся сосуды. Нанесите каплю теплого 2%-ного аэроса, растворенного в спинномозговой жидкости, и немедленно накройте стекло на трепанацию черепа.

Во-первых, гелевая пена, пропитанная спинномозговой жидкостью, вокруг внешней стороны покровного стекла, чтобы предотвратить высыхание агроса во время визуализации собственного сигнала. Затем прикрепите камеру CCG с изображением собственного сигнала к стандартному порту крепления C в верхней части двух фотомикроскопов и поместите источник света на воздушный стол рядом с положением столика XY и закрепите световод над краниотомией. Втяните первичную дихроию и зеркало ниже порта подводной горы так, чтобы отраженный красный свет, необходимый для собственных сигналов, проходил непосредственно от краниотомии к ПЗС-камере.

Вставьте инфракрасный фильтр в световой тракт, чтобы предотвратить нагрев коры головного мозга. Затем установите фильтр, пропускающий зеленый свет, и запишите цифровое эталонное изображение корковой поверхности кровеносных сосудов. Затем переместите фокус Z на 500 микрон ниже поверхности коры головного мозга.

Замените зеленый фильтр на красный, чтобы осветить кору головного мозга для измерения собственных сигналов. Следите за тем, чтобы кора головного мозга равномерно освещалась. Защитите трепанацию черепа от света, производимого дисплеем визуальных стимулов, и представьте последовательность визуальных стимулов и запишите изображения с данными о отражении для создания карты ориентации В течение 10 минут соберите данные, соответствующие четырем повторениям последовательности из восьми стимулов с четырьмя ориентациями и двумя направлениями для каждой ориентации.

Теперь проанализируйте данные о собственном сигнале, чтобы создать цветовую карту ложной ориентации, как показано здесь. Затем выберите потенциальные целевые области для двухфотонной маркировки нейронов. Например, сингулярности ориентации вертушки указывают на карту, где сходятся все предпочтительные ориентации.

Затем наложите карту ориентации и изображение сосудистой сети коры головного мозга и используйте схему функциональных доменов и расположение крупных поверхностных сосудов для выбора мишени, избегая мест с крупными кровеносными сосудами и артериями. Приготовьте флуоресцентные растворы D и вытяните длинную коническую пипетку в соответствии с инструкциями в письменном протоколе. Загрузите в пипетку пять микролитров смеси красителей.

Затем удалите последний слой твердой мозговой оболочки, чтобы облегчить введение пипетки, и получите двухфотонное изображение высочайшего качества, как показано на этой диаграмме. Пипетка должна быть введена в кору головного мозга под углом 30 градусов, чтобы пройти между камерой и объективом. Таким образом, расположение кортикальной поверхности в месте входа пипетки не будет находиться непосредственно над целевой областью интереса.

Например, для маркировки целевой области, находящейся на 200 микрон ниже поверхности коры головного мозга, положение входа пипетки на поверхности коры головного мозга должно быть примерно на 350 микрон латеральнее целевого положения. Переместите XY-ступень в центр положения входа в кортикальную поверхность под объективом 20 x или 40 x. После того, как входное положение будет отцентрировано под объективом, поднимите Z-положение объектива на два миллиметра.

Затем включите зеленый эпифлуоресцентный свет, визуализируйте красный краситель Alexa в пипетке и перемещайте пипетку до тех пор, пока кончик не окажется над положением входа в кортикальную поверхность. Рассматривая наконечник пипетки через окуляр микроскопа со светлопольным освещением, опускайте пипетку до тех пор, пока наконечник не достигнет желаемого положения входа на поверхности коры головного мозга. Затем снимите объектив и используйте безворсовые абсорбционные копья, чтобы отвести избыток спинномозговой жидкости из краниотомии и высушить прилегающую кость.

Затем наносят каплю теплой 3%-ной розы, растворенной в А ликворе для стабилизации коры головного мозга. Как только арос застынет, вставьте объектив 40 раз и снова заполните камеру спинномозговой жидкостью. Далее с помощью диагональной оси микроманипулятора перемещайте пипетку до тех пор, пока наконечник не достигнет нужной глубины в коре головного мозга.

Периодические затяжки под давлением смеси DI уменьшают вероятность засорения наконечника пипетки, когда пипетка достигает второго слоя, три небольшие затяжки смеси DI осветят дополнительное клеточное пространство и обнаружат плотную сборку круглых клеточных тел в виде темных теней для загрузки нейронных тел в сфере коры от 300 до 600 микрон в диаметре. Введите смесь Дикса во внеклеточное пространство с помощью от 30 до 90 импульсов. Каждый импульс составляет одну секунду, от двух до 10 фунтов на квадратный дюйм.

После того, как инъекция будет завершена, подождите несколько минут, затем извлеките пипетку и объектив. Флуоресцентный индикатор кальция будет полностью поглощен нейронами за один час. Наконец, снимите отверстия, используемые для загрузки, и промойте камеру записи.

Нанесите небольшую каплю от двух до 3% возникших на поверхность и быстро поместите покровное стекло на трепанацию черепа. Вставьте объектив с высоким коэффициентом NA 20 x в держатель объектива и отцентрируйте помеченную область коры головного мозга под объективом. С помощью XY-ступени можно защитить трепанацию черепа от посторонних источников света и собрать изображения помеченных нейронов с высоким разрешением in vivo.

В качестве альтернативы, электропорация одиночных клеток может быть использована для изучения морфологии дендритов или функциональной визуализации дендритов. В этой методике ДИ подготавливаются в соответствии с письменным протоколом. Затем в соответствующем месте процедуры наконечник пипетки располагается рядом с мембраной тела нейронной клетки, и с помощью аксо подается от одного до трех импульсов.

Немедленное заполнение нейрона красителем легко визуализируется с помощью двухфотонной микроскопии. На этом изображении показана двухфотонная область, показывающая тела клеток, помеченные флуоресцентным индикатором кальция OGB 1:00 AM в слое зрительной коры два три, масштабная линейка представляет 100 микрон. На этом изображении показано предпочтение ориентации отдельных тел нейронных клеток из того же места, что показано на предыдущем изображении.

Организованная карта предпочтительной ориентации стимула видна вокруг сингулярности вертушки, которая была центрирована в отображаемой области. Здесь мы видим карту ориентации, полученную с помощью визуализации собственного сигнала. Черный квадрат соответствует области, показанной на предыдущем двухфотонном изображении.

На этом изображении показаны дендриты и тело клетки одного нейрона, наложенные на карту ориентации. Нейрон был электропорирован с помощью Alexa floor 5 94 под двухфотонным контролем. Поскольку стек Z был собран in vivo, дендритные процессы были прослежены в автономном режиме с использованием нейролюмида в качестве программного обеспечения.

Карта ориентации была получена с помощью визуализации собственного сигнала перед электропорацией одиночных клеток. Масштабная линейка представляет собой 100 микрон. Эта проекция Z размером 10 микрон от первого слоя коры головного мозга показывает апикальные дендриты.

Красными стрелками показаны шипы вдоль дендритов, в то время как эти 10-микронные Z-проекции от коркового слоя два-три показывают базальные дендриты с шипами, обозначенными красными стрелками, и аксонами, обозначенными белыми стрелками. Этот метод полезен для изучения функциональных карт в коре головного мозга в различных пространственных масштабах и для точного нацеливания на нейроны в конкретной интересующей области. В рамках карты мы продемонстрировали применение метода для изучения карт ориентации, но он может быть расширен на другие карты зрительных особенностей, такие как сетчатка, топпи, глазное доминирование и направление, или на другие сенсорные модальности, которые имеют функционально организованные карты, такие как те, которые кодируют ощущение сомато или слух.