Citrobacter rodentium Mouse Model: изучение патогенности и Хост Взносы в инфекционным колитом

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы вызвать колит путем заражения мышей грамотрицательным зеркальным патогеном, грызуном citrobacter, что позволяет изучать взаимодействие патогена и хозяина в желудочно-кишечном тракте. Это достигается за счет первой прививки, культуры нулевого выкупа в одночасье. На втором этапе мыши заражаются через ротовую зондовую зондию с ночным инокулюмом.

Затем, на седьмой день после заражения, слепая кишка толстой кишки и содержимое просвета собираются на заключительном этапе. Ткани покрываются пластинами, подсчитываются колонии бактерий и ткани подвергаются иммуноокрашиванию в отношении белков хозяина, представляющих интерес. В конечном счете, патогенная нагрузка, барьерная функция, гистологические повреждения и изменения в реакции хозяина могут быть оценены с помощью иммуногистохимии.

Хотя этот метод предлагает надежную модель инфекционного колита, позволяющую изучать взаимодействия патогенов хозяина и иммунные реакции, он также может быть адаптирован для изучения влияния бактериальной инфекции на риск развития рака толстой кишки. Как правило, у индивидуумов, новичков в этом методе, они естественным образом борются с бактериальной инфекцией мышей, с ними или с ними. Начните с использования стерильной инокуляционной петли, чтобы нанести жизнеспособный раствор C из замороженного глицерина на гальваническую пластину LB.

После ночной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия используйте инокуляционную петлю для переноса колоний из планшета LB в три миллилитра стерильного бульона. Затем инкубируйте культуру ERO Dunum аэробным способом в настольном инкубационном шейкере со скоростью 200 об/мин в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующее утро привитый бульон должен казаться мутным.

Аккуратно взбалтывайте культуру, чтобы равномерно распределить культуру бактериальных клеток, а затем загрузите одномиллилитровый шприц бульоном и приложите его к игле для желудочного зонда. Выберите мышь для гаважа, крепко обхватив дряблую кожу на ее шее и спине фемом и пальцами. Затем оттяните голову животного указательным пальцем, чтобы обездвижить голову животного и выпрямить пищевод для введения.

Удерживая мышь в вертикальном положении, направьте кончик луковицы иглы желудочного зонда вдоль боковой части рта животного и над его языком. Аккуратно проведите иглой по нёбу животного и продвигайте иглу вниз по пищеводу. Наконец, с помощью шприца медленно введите 100 микролитров бактериального инокулюма, а затем аккуратно удалите иглу зондажа.

Следите за частотой дыхания и поведением мыши после возвращения ей клетки, ее клетки в день проведения пробы, потрепайте мышь, как только что продемонстрировано, а затем намочите животное 150 микролитрами свежеприготовленного фитзи декстрина. Изымайте корм из клетки в это время, через четыре часа после зондирования, а затем седативного успокоения животного. Используйте пункцию сердца, чтобы собрать как можно больше крови у животного, находящегося под наркозом.

Добавьте кровь до конечной концентрации 3%-ной кислоты цитрата декстрозы в микроцентрифужную пробирку, чтобы предотвратить свертываемость. Затем уменьшите количество образцов крови в течение 12 минут при температуре 1000 сыра и четырех градусах Цельсия. Затем соберите сыворотку и выдавите ее в соотношении один к 10 и один к 100 в PBS по 100 микролитров каждого образца.

При этом разведение до 96 лунки планшета в двух экземплярах. Для подготовки стандартной кривой разведите 100 микролитровых образцов из исходных 80 миллиграммов на миллилитр. Фитц Декстрин использовал для измерения мышей в PBS в темных микроцентрифужных пробирках.

Затем добавьте стандартные образцы в 96-луночный планшет в трех экземплярах. Затем используйте флуориметр для количественной оценки флуоресценции каждого образца и для определения концентрации декстрина FXI с помощью асептического метода, начните этот шаг с добавления одного миллилитра стерильного PBS и автоклавного металлического шарика на круглое дно в двухмиллилитровые центрифужные пробирки. Затем взвесьте каждую трубку.

Далее, после снятия сывороточного и двоеточника с мыши, отделите сыворотку от толстой кишки и разрежьте их в продольном направлении. Соберите содержимое просвета с помощью щипцов и добавьте содержимое в пробирку с PBS. Промойте продолжение и ткани толстой кишки стерильным PBS перед тем, как поместить их в отдельные пробирки.

Теперь взвесьте пробирки с тканью и гомогенизируйте образцы с помощью бисерной венчика в течение шести минут. При 30 герцах добавьте 180 микролитров стерильного PBS на лунку в 96-луночный планшет. Затем добавьте по 20 микролитров каждого гомогенизированного образца в первую лунку в каждом ряду и хорошо перемешайте.

Последовательно разбавляйте образцы, добавляя по 20 микролитров из каждой предыдущей лунки для получения разбавления от 10 до минус одного в первой лунке до 10 до минус шести. Затем поместите по 10 микролитров каждого разведения из каждого образца в трех экземплярах на планшет LB с квадратным дном и сеткой после ночной инкубации при 37 градусах Цельсия. Подсчитайте колониеобразующие единицы на одной пластине.

Усредните тройные значения для каждой пробы, а затем запишите степень разведения, при которой подсчитывалась каждая проба. Умножьте среднее значение КОЕ на 50 и на коэффициент разбавления, при котором была подсчитана проба, в результате чего КОЕ приходится на миллилитр. Наконец, разделите на массу ткани для определения КОЕ на грамм после ночного формализации и фиксации ранее сохраненного 0,5-сантиметрового участка толстой кишки и секума.

На следующее утро промойте салфетки 70% этанолом и поместите в кассету, чтобы отправить в гистологическое учреждение, где их закапывают в парафин и окрашивают гематином и эозином, чтобы депарировать ткани. Поместите предметные стекла в банку для окрашивания коплана на водяную баню при температуре 65 градусов Цельсия на 10 минут. Теперь поместите предметные стекла в ксилол на четыре стирки по две минуты.

Каждый раз увлажните предметные стекла двумя пятиминутными промывками и 100% этанолом, а затем одним пятиминутным промыванием в каждом из следующих слоев. 95% этанол, 75% этанол и дистиллированная вода. Поместите вымытые предметные стекла в банку Coplan с предварительно подогретым буфером цитрата натрия, а затем поместите банку в пароварку на 30 минут, дав банке постоять при комнатной температуре еще 30 минут, вымойте предметные стекла три раза PBS Zied в течение пяти минут.

Когда предметные стекла высохнут, отметьте область вокруг ткани пап-ручкой. Затем заблокируйте ткань блокирующим буфером в иммуноокрашивающей влагокамере при комнатной температуре. Через час слейте блокирующий буфер и инкубируйте ткани в 50-100 микролитрах первичного антитела при четырех градусах Цельсия в течение ночи.

После инкубационного периода трижды промойте салфетки PBS Azi в течение пяти минут. Затем инкубируйте предметные стекла в 50-100 микролитрах вторичного антитела в темноте при комнатной температуре через час, трижды промыть предметные стекла дистиллированной водой в течение пяти минут. Наконец, обезвоживают ткани, покрывают стекла dpi, продлевают золотой монтажный материал, а затем прикладывают покровный лист, просматриваемый под флуоресцентным микроскопом.

На этом первом рисунке показан декстрин Фитца, измеренный в сыворотке крови черных шести мышей C 57, а также от толл-подобного рецептора до нокаутных мышей, у которых ранее было обнаружено нарушение целостности эпителиального барьера во время инфекции в присутствии интактного кишечного эпителиального барьера. Декстрин ZI плохо пропускается через этот слой. Таким образом, повышенные уровни декстрина Фитц в сыворотке указывают на нарушение целостности кишечного эпителиального барьера во время инфекции, что позволяет этой молекуле просачиваться в качестве контрольного уровня в сыворотке крови у неинфицированных мышей.

Также представлены гаваж с декстрином Фитца. Ассент — это люминальный патоген, который может плотно прикрепляться к эпителиальным клеткам кишечника. Бактериальная нагрузка в содержимом просвета, последствиях и тканях толстой кишки может быть на седьмой день. После заражения.

Было обнаружено, что бактериальная нагрузка в толстой кишке достигает пика в районе от 10 до девяти КОЕ на грамм. Большая часть патологии, наблюдаемой во время инфекции C DUM у шести мышей C 57 PL, возникает в дистальных двух сантиметрах толстой кишки макроскопически к седьмому дню после заражения. Утолщение слизистой оболочки толстой кишки, а также укорочение и длина толстой кишки в норме наблюдаются при инфицировании.

У шести мышей C 57 PL наблюдаются лишь умеренные воспаления и патологии, которые гистологически характеризуются инфильтрацией иммунных клеток, удлинением крипт толстой кишки и истощением коит-клеток. Для дальнейшей характеристики реакций хозяина, возникших во время инфицирования с нулевым погашением, иммунофлуоресцентное окрашивание может быть использовано для изучения изменений в представляющих интерес белках, таких как маркеры пролиферации, или для изучения аспектов бактериального ответа, таких как его локализация в инфицированной ткани. На этом рисунке показан пример этой техники окрашивания, в которой исследуется белок хозяина KI 67, маркер пролиферации клеток, который отображается красным цветом, и нулевой разрыв белка, который отображается зеленым цветом для изучения локализации бактерий на 12-й день после заражения.

После освоения этой техники ее можно выполнить за считанные минуты, если все сделано правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно, чтобы техника измерения была выполнена правильно, чтобы убедиться, что мыши инфицированы и что здоровье животного контролируется на протяжении всего периода инфекции. За последние 10-15 лет модель грызунов citrobacter стала золотым стандартом для изучения прикрепления к столкновению с бактериальными патогенами, такими как epec.

Более того, он стал общепризнанной моделью для изучения иммунных реакций слизистых оболочек на бактерии, таких как развитие реакций TH-17 в кишечнике.