Улучшенный протокол для лазерных микродиссекции человека панкреатических островков от хирургических образцах
6 января 2013 г.
Лазерная микродиссекции является метод, который позволяет восстановление выделенных ячеек незначительное количество паренхимы. Здесь мы опишем протокол для приобретения человеческих панкреатических островков из операционного материала, который будет использоваться для транскриптомных исследований. Наш протокол улучшает внутреннее аутофлюоресценции человека бета-клетки, способствуя тем самым их коллекции.
Здравствуйте, меня зовут Дорте, я представляю Институт Теа Хэндс при Технологическом университете, Reen Laser. Микродиссекция — это метод, который позволяет выделить специфическую популяцию клеток из очень малых количеств исходной опухоли. Диссекированные клетки могут быть использованы для транскриптомных и протеомных исследований, оценки ДНК или хромосомного анализа.
Здесь мы представляем наш протокол получения мета-клеток поджелудочной железы человека из хирургических образцов для использования в транскриптомных исследованиях. Разрежьте ткань поджелудочной железы на мелкие кусочки. Поместите один кусочек в центр криоформы и залейте его охлажденным компаундом для заливки.
Немедленно заморозьте ткань, используя охлажденный материал Bhutan, и храните при температуре -80 °C. Маркируйте 40 адгезивных предметных стекол и предварительно охладите их в криокамере. После подрезки криоблока зафиксируйте замороженную ткань на держателе образцов с помощью соединения OCT.
Сделайте 40 срезов толщиной 10 мкм. Перенесите один срез на один предметное стекло, коснувшись пальцем тыльной стороны стекла, чтобы прогреть только то место, куда будет помещен срез. Выдержите срезы от двух до трех минут в криостате, после чего храните их при температуре -80 °C; подготовьте реагенты для окрашивания и охладите все жидкости, кроме салина, на льду. Это усилит собственную аутофлуоресценцию клеток ПЭТ перед микродиссекцией.
Каждый раз будет обрабатываться по четыре среза. Работайте с двумя срезами одновременно. Сначала зафиксируйте их в 70% ethanol в течение 30 секунд.
Затем промойте срезы, быстро погружая их в воду с DPC пять или шесть раз. После этого обезвоживайте ткань в течение одной минуты в 100% этаноле, повторив этот шаг, а затем инкубируйте предметные стекла в селине в течение четырех минут.
Тем временем начните дегидратацию еще одной пары срезов. В завершение высушите предметные стекла на воздухе в течение трех-пяти минут в темноте. Чтобы защитить ткань от воздействия влаги, а автофлуоресценцию — от выцветания, поместите два предметных стекла спина к спину в пробирку объемом 50 мл, обернутую фольгой. Перед началом работы очистите микроскоп с помощью RNAs away и закрепите адгезивный колпачок в robo Mover.
Поместите предметное стекло на предметный столик и переместите колпачок вплотную к срезу, не касаясь его. Найдите глазковые тельца, определив области с аутофлуоресценцией бета-клеток. В данной установке собственная аутофлуоресценция бета-клеток человека имеет желтый цвет, в то время как протоки поджелудочной железы проявляют ярко-зеленую аутофлуоресценцию.
С помощью инструмента свободного выделения выберите наиболее подходящие области клеток и проведите их микродиссекцию, запустив лазер. За 40–60 минут диссецируйте глазковые зоны четырех криосрезов в одну адгезивную колпачок. При необходимости проверьте захваченную ткань, переместив колпачок в контрольную точку микроскопа.
Снимите колпачок из робота-переместителя и внесите в крышку колпачка 10 µL экстракционного буфера для разрушения клеток. Инкубируйте колпачок в перевернутом состоянии при 42 °C в течение 30 минут.
Центрифугируйте лизат, промаркируйте пробирку и храните ее при температуре -80 °C до начала экстракции РНК. Проведите лазерную микродиссекцию и лизис для всех 40 криодиссектов. После этого объедините 10 лизатов и приступите к изоляции РНК с использованием набора UR PU RNA isolation kit в соответствии с прилагаемым протоколом, чтобы получить 11 µL РНК.
В целом мы не обнаружили прямой зависимости между количеством микродиссекированной ткани и выходом РНК. Различия во временном интервале между забором материала хирургами и замораживанием образца поджелудочной железы после его исследования патологом могли частично повлиять на качество и количество выделенной РНК. Другими ключевыми факторами, которые следует учитывать, являются энергия лазера, используемая для микродиссекции (при более низкой энергии выше целостность РНК), а также фокусировка лазера и расстояние между точками воздействия лазерного резака. Кроме того, количество РНК можно оптимизировать, максимально сокращая расстояние между адгезивной крышкой и образцом.
Избегайте потери микродиссекированного материала в процессе захвата, при условии наличия микродиссекционного лазерного микроскопа. Данная процедура может быть внедрена в любом исследовательском учреждении, где выполняются частичные панкреатэктомии, что расширит доступ к материалу тканей поджелудочной железы как от лиц без сахарного диабета, так и от пациентов с этим заболеванием.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол лазерной микродиссекции для выделения островков поджелудочной железы человека из операционного материала. Данный метод позволяет улучшить сбор бета-клеток для транскриптомных исследований.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Транскриптомика
Теоретические основы
- Лазерная микродиссекция позволяет изолировать специфические популяции клеток.
- Она особенно полезна при работе с небольшими образцами тканей.
- Данный метод может быть применен в различных исследованиях, включая транскриптомный и протеомный анализы.
- Улучшение автофлуоресценции способствует более точному сбору целевых клеток.
Цель исследования
- Предоставить подробный протокол выделения островков поджелудочной железы человека.
- Облегчить изучение бета-клеток в транскриптомных исследованиях.
- Повысить эффективность сбора клеток из хирургических образцов.
Используемые методы
- Метод лазерной микродиссекции, примененный к ткани поджелудочной железы.
- Подготовка образцов ткани путем нарезания на мелкие фрагменты.
- Заливка ткани в охлажденное соединение для оптимальной диссекции.
- Сбор бета-клеток для дальнейшего анализа.
Основные результаты
- Успешное выделение островков поджелудочной железы человека.
- Наблюдалось улучшение автофлуоресценции бета-клеток.
- Протокол продемонстрировал эффективность для транскриптомных исследований.
- Обеспечен сбор целевых популяций клеток из малых образцов.
Выводы
- Данный протокол повышает эффективность извлечения островков поджелудочной железы человека.
- Лазерная микродиссекция является ценным инструментом для клеточного анализа.
- Улучшенные методы позволяют получить более точные данные в транскриптомных исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Лазерная микродиссекция позволяет точно изолировать бета-клетки поджелудочной железы человека из ограниченных хирургических образцов, устраняя критическое препятствие в транскриптомных исследованиях тканей, имеющих значение для изучения диабета. Благодаря усилению собственной автофлуоресценции за счет обработки реагентами при ледяной температуре, данный протокол сокращает время работы с тканью и улучшает сохранность RNA, что напрямую способствует валидации мишеней в исследованиях метаболических заболеваний. Этот подход усиливает механистическое снижение рисков, обеспечивая получение очищенных популяций клеток для последующего применения омиксных технологий в рабочих процессах раннего поиска лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем выделения чистых популяций бета-клеток для анализа сигнальных путей в моделях сахарного диабета 2 типа.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет быстрого и точного определения целевых клеток с помощью усиленной автофлуоресценции, что уменьшает количество ложноположительных результатов при выборе мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для стандартизации анализа путем обеспечения стабильного ввода высококачественной РНК из микродиссекированных островков.
- Практическая ценность: Обеспечение воспроизводимых количественных результатов, необходимых для подготовки к скринингу и повторного использования платформы в процессах поиска биомаркеров.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает актуальность исследования заболевания, позволяя проводить транскриптомный анализ островков поджелудочной железы человека, непосредственно связанных с патофизиологией диабета.
- Практическая ценность: обеспечивает преемственность этапов от открытия до доклинической валидации, предоставляя определенные клеточные популяции для последующих исследований механизмов действия.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс научных открытий, обеспечивая проверку гипотез на ранних этапах биологических исследований, поддерживая разработку анализов за счет стандартизированных исходных данных и обосновывая трансляционные решения с помощью количественного молекулярного профилирования.
- Открытия в биологии: способствует уточнению путей передачи сигналов и снижению биологических рисков путем выделения бета-клеток для функциональной валидации мишеней в моделях метаболических заболеваний.
- Скрининг: обеспечивает получение образцов, готовых к анализу, с воспроизводимым выходом РНК, что критически важно для скрининга влияния соединений на изолированные островки.
- Аналитика: позволяет получать количественные транскриптомные данные для сравнения диабетического и недиабетического состояний с целью идентификации перспективных соединений.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность доклинических исследований, предоставляя релевантные образцы человеческого происхождения, которые связывают результаты in vitro с механизмами заболевания.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного использования метода получения первичных островков человека в различных проектах, снижая зависимость от вариабельности донорских источников.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования за счет устранения механистической неопределенности в путях передачи сигналов, специфичных для бета-клеток.
- Практическая ценность: Улучшает стандартизацию и воспроизводимость благодаря контролируемой обработке тканей и определенным параметрам диссекции.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет возможности ранней оценки взаимодействия с мишенью в релевантных клетках человека, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию мишеней для лечения диабета с учетом рисков на основе валидированных транскриптомных профилей островков человека.
Особенности внедрения
- Требуются навыки в области гистологии, криосекционирования и работы с оборудованием для лазерной микродиссекции.
- Зависит от наличия системы PALM MicroBeam или эквивалентной LMD-платформы с функцией AutoLPC.
- Необходимы стандартизированные протоколы работы с реагентами для сохранения автофлуоресценции и целостности RNA у всех пользователей.
- Требуется учитывать особенности адаптации в зависимости от качества образцов поджелудочной железы и времени ишемии между забором и заморозкой.
- Ограничено низким выходом RNA, что требует объединения нескольких микродиссекционных образцов для получения достаточного количества материала для последующих наборов реагентов.
