Улучшенный протокол для лазерных микродиссекции человека панкреатических островков от хирургических образцах

Здравствуйте, меня зовут Дорте из Института Теи Руки при Технологическом университете, Рин Лазер. Микродиссекция – это метод, который позволяет получить особую популяцию клеток из очень небольшого количества исходной опухоли. Препарированные клетки могут быть использованы для транскриптомных и протеомных исследований, оценки ДНК или хромосомного анализа.

В этой статье мы приводим наш протокол получения метаклеток поджелудочной железы человека из хирургических образцов для использования в транскриптомных исследованиях. Разрежьте ткань поджелудочной железы на небольшие кусочки. Поместите одну деталь в центр криоформы и накройте ее охлажденным закладочным составом.

Заморозьте ткань немедленно с помощью охлажденного двух бутанских материалов и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Разделка этикетки на 40 клеевых стеков и предварительное их охлаждение внутри камеры Христа. Зафиксируйте замороженную ткань на держателе образца с помощью ОКТ-компаунда после обрезки криоблока.

Отрежьте 40 секций толщиной 10 микрометров. Перенесите одну секцию на одну горку, коснувшись пальцем обратной стороны слайда, чтобы прогреть только позицию для размещения секции на ней. Попробуйте срезы две-три минуты внутри криоса мертвыми и храните их после этого при температуре минус 80 градусов Цельсия, приготовьте реактивы Ation и охладите все жидкости, кроме селина, на льду. Это увеличит собственную автофлуоресценцию клеток домашних животных до микродиссекции.

Каждый раз четыре секции будут девальвированы. Работайте с двумя секциями одновременно. Сначала зафиксируйте их в 70% этаноле в течение 30 секунд.

Затем промойте пряди пятью-шестью быстрыми погружениями. В дальнейшем в ЦОД вода очищается. Обезвожьте ткань в течение одной минуты в 100% этаноле и повторите этот шаг, инкубируйте слайды в селине в течение четырех минут.

Тем временем приступают к обезвоживанию еще одной пары секций. Наконец, высушите предметные стекла на воздухе в течение трех-пяти минут в темноте. Защитите ткань от влаги и автофлуоресценцию от обесцвечивания, поместив два предметных стекла друг к другу в фольгу Обернуть пробирку 50 мл Перед срезом очистите микроскоп от РНК и зажмите клейкий колпачок в роботизированном движителе.

Вставьте слайд в рабочую область и переместите колпачок близко к секции, не касаясь ее. Локализуйте люверсы, определив автофлуоресцентные лучше клеточные участки. Внутренняя аутофлуоресценция лучших клеток человека выглядит желтой в организме, в то время как протоки поджелудочной железы демонстрируют ярко-зеленую аутофлуоресценцию.

Выделите лучшие участки клеток с помощью инструмента выделения свободной рукой и рассеките их, запустив лазер. Рассеките люверсы четырех дефорсированных криосекций в один клеевой колпачок в течение 40-60 минут. При желании проверьте захваченную ткань, переместив колпачок в контрольную точку микроскопа.

Снимите колпачок с робота-движителя и накачайте его. 10 мкл экстракционного буфера в крышку колпачка для разрушения клеток. Выдержите крышку вверх дном при температуре 42 градуса Цельсия в течение 30 минут.

Уменьшите лизат, пометьте пробирку и храните ее при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока не произойдет экстракция РНК. Выполните лазер Ation, микродиссекцию и лизис со всеми 40 криодиссекциями. После этого соедините 10 лизатов и продолжайте выделение РНК с помощью изоляционного набора UR PU RNA, следуя прилагаемому протоколу, чтобы получить 11 микролитров РНК.

В целом, мы не обнаружили прямой связи между количеством микродиссектной ткани и выходом РНК Различия во временном интервале между забором материала хирургами и замораживанием образца поджелудочной железы после его исследования патологоанатомом могут частично объяснить качество и количество восстановленной РНК. Другими ключевыми факторами, которые следует учитывать, являются энергия лазера, применяемая для микродиссекции с более низкой энергией с использованием более высокой целостности РНК, а также фокус лазера и расстояние до точек наведения лазерного резака. Кроме того, количество РНК может быть оптимизировано путем поддержания как можно более низкого расстояния между адгезивным колпачком и колпачком.

Избегайте потери микрорассекаемой ткани в процессе сканирования при условии наличия лазерного микродиссекционного микроскопа. Эта процедура может быть реализована в любых исследовательских учреждениях, выполняющих частичную эктомию поджелудочной железы, тем самым увеличивая доступ к материалу век человека как у недиабетиков, так и у диабетиков.