Подсчет клеток с помощью гемоцитометра

Подсчет клеток является важным этапом во многих анализах с использованием клеточных культур для определения количества и жизнеспособности клеток. В целом, целью подсчета является определение степени разведения образца с неизвестной концентрацией клеток для его дальнейшего использования. Наиболее распространенным лабораторным инструментом для подсчета клеток является гемоцитометр.

Гемацитометр — это инструмент для подсчета, изначально созданный для определения количества клеток крови. В центре гемацитометра расположены две счетные камеры, на которых нанесена вытравленная лазером сетка.

Сетка состоит из 9 основных квадратов. Четыре угловых квадрата дополнительно разделены на 16 более мелких квадратов. Центральный квадрат разделен на 25 таких же мелких квадратов, каждый из которых, в свою очередь, разделен на 16 микроквадратов.

С дальнего края каждой камеры расположены отверстия для ввода образца, в которые вносится образец клеток для подсчета.

По обе стороны от счетных камер находятся опоры для установки покровного стекла, на которых лежит кварцевое покровное стекло, обычно на расстоянии около 0.1 mm над счетной камерой.

Поскольку площадь каждого большого квадрата составляет 1 mm2, объем под каждым большим квадратом равен 0.1 mm3 или 1/10 000 мл.

Перед началом подсчета обязательно протрите покровное стекло и счетную камеру этанолом с помощью салфетки Kimwipe, чтобы удалить ворс, отпечатки пальцев или следы воды и высушить поверхность.

Затем аккуратно добавьте небольшое количество воды на каждую из опор для крепления покровного стекла; поверхностное натяжение воды зафиксирует стекло на месте.

Теперь осторожно тритурируйте клеточную суспензию или несколько раз пропустите ее через пипетку, чтобы разрушить клеточные агрегаты. С помощью микропипетки возьмите около 10 μl суспензии и внесите образец в одно из загрузочных отверстий. Раствор будет втягиваться в счетную камеру за счет капиллярного эффекта и должен полностью покрыть сетку.

Пока клетки оседают, выберите объектив. Затем установите гемоцитометр на предметный столик.

Далее рассмотрите клетки под микроскопом. Если в каждом из больших квадратов находится менее 5 клеток, возможно, потребуется снова центрифугировать образец и ресуспендировать осадок в меньшем объеме. Если клетки перекрывают друг друга или расположены слишком плотно, чтобы их можно было легко различить, образец следует развести в большем объеме раствора. Обязательно зафиксируйте коэффициент разведения клеток, так как он понадобится при последующих расчетах.

Теперь можно приступать к подсчету клеток!

Как мы говорили ранее, камера для подсчета покрыта нанесенной лазером сеткой. Линии квадрантов облегчают отслеживание подсчитываемых клеток. Выбирайте размер квадранта для подсчета в зависимости от плотности клеток в вашем образце. Например, если количество клеток мало, подсчитайте все клетки в одном из угловых квадрантов. Для образцов со средним количеством клеток выберите один из 16 меньших квадрантов. При очень высокой плотности клеток подсчитайте клетки в одном из 25 центральных квадрантов. Независимо от выбранного квадранта или плотности клеточного образца, подсчитывайте не менее 20-50 клеток на квадрант.

Не все клетки будут находиться строго внутри квадрантов. Вы можете считать клетки, которые касаются верхней и левой линий, но не учитывайте те, что касаются нижней или правой. Для получения наиболее точного подсчета используйте счетчик клеток для отслеживания и вычислите среднее количество клеток в 4 квадрантах одного размера.

Чтобы рассчитать количество клеток в объеме 1 ml, умножьте количество подсчитанных клеток на 10,000, поскольку, как мы упоминали ранее, каждый большой квадрат на сетке составляет 1/10,000 от ml. Если вы считали один из этих больших квадрантов, просто умножьте это число на 1. Если вы считали один из меньших квадратов в одном из угловых квадрантов, умножьте это число на 16. Если вы считали все клетки в одном из 25 центральных квадрантов, умножьте это число на 25. Если вы разбавляли клеточную суспензию перед заполнением гемоцитометра, вам также потребуется умножить результат на коэффициент разведения.

Затем, чтобы рассчитать количество клеток в 1 ml этого образца, мы умножим 20 клеток в этом центральном квадранте на 10^4 и 25, чтобы получить в итоге 5 x 10^6 клеток в 1 ml образца.

Теперь, когда мы знаем общее количество клеток в 1 ml образца, нам нужно умножить это число на общий объем нашего раствора. Например, если у нас 5 x 10^6 клеток в 1 ml, то в 2 ml будет всего 1 x 10^7 клеток.

Затем, чтобы избежать ошибок из-за неправильного подсчета, неравномерного распределения клеток или ошибок пипетирования, заполните другую сторону камеры и подсчитайте ваш клеточный образец второй раз.

Подсчет клеток под микроскопом также является отличной возможностью оценить жизнеспособность клеток в вашем образце. Для этой цели перед загрузкой в гемоцитометр в образец часто добавляют трипановый синий — витальный краситель.

Живые клетки не пропускают этот краситель, так как они очень избирательны в отношении веществ, проникающих через их мембраны. Однако мертвая клетка не имеет целостной мембраны, что позволяет трипановому синему проникнуть внутрь и окрасить цитоплазму.

Чтобы проверить жизнеспособность вашего образца клеток, разбавьте аликвоту суспензии клеток раствором трипанового синего, а затем загрузите окрашенный образец точно так же, как и обычный образец клеток. При фазово-контрастном освещении живые клетки будут выглядеть светлыми и золотистыми, и именно их следует считать; не считайте тусклые синие мертвые клетки.

Рассчитайте количество клеток, как и прежде, но на этот раз умножьте итоговое число на коэффициент разбавления трипановым синим. Таким образом, если наш исходный репрезентативный образец был предварительно разбавлен трипановым синим, мы бы умножили общее количество клеток на коэффициент разбавления 1:10, что в итоге дало бы 1x108 клеток в нашем образце.

По завершении подсчета не забудьте очистить покровное стекло и счетную камеру!

Теперь, когда вы в совершенстве овладели методом подсчета клеток, давайте обсудим причины, по которым в конкретном эксперименте может потребоваться точно знать количество имеющихся клеток.

После выделения клеток из нормальной или экспериментальной ткани важно знать, сколько клеток было получено. В данном случае исследователям необходимо определить количество спленоцитов, или клеток селезенки, выделенных из селезенки данной мыши.

При проведении эксперимента по изучению взаимодействия двух различных популяций клеток важно знать количество каждого типа клеток, которые смешиваются, как в этом эксперименте по совместному культивированию B- и T-клеток.

Информация о количестве клеток потребуется и для многих других типов клеточных анализов. Здесь подготавливается анализ ELISPOT для определения количества клеток в образце, которые будут секретировать IFNγ (провоспалительный белок) в ответ на воздействие вируса папилломы человека.

При проведении эксперимента, в котором требуется экстрагировать или выделить мРНК из интересующих вас клеток, важно знать исходное количество клеток, чтобы получить достаточное количество мРНК для проведения анализа.

Гемоцитометр — это недорогой и относительно простой в использовании инструмент для подсчета клеток, однако работа с ним может быть трудоемкой и сопряжена с риском человеческой ошибки.

Scepter Handheld Automatic Counter представляет собой, как следует из названия, ручной счетный прибор, который обладает более высокой точностью подсчета по сравнению с гемоцитометром и способен определять как размер, так и объем клеток в образце.

Автоматический счетчик клеток TC10 оценивает как количество, так и жизнеспособность клеток, автоматически рассчитывает общее число клеток в образце, а также позволяет просматривать изображения клеток на экране устройства.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по подсчету клеток. В этом ролике мы рассмотрели: что такое гемоцитометр, как подсчитывать клетки и определять их жизнеспособность, а также основные причины, по которым может возникнуть необходимость в подсчете клеток. Спасибо за просмотр и помните, что синие клетки считать не нужно!