Подсчет клеток с помощью гемоцитометра
Подсчет клеток является важным этапом во многих анализах с использованием клеточных культур для определения количества и жизнеспособности клеток. В целом, целью подсчета является определение степени разведения образца с неизвестной концентрацией клеток для его дальнейшего использования. Наиболее распространенным лабораторным инструментом для подсчета клеток является гемоцитометр.
Гемацитометр — это инструмент для подсчета, изначально созданный для определения количества клеток крови. В центре гемацитометра расположены две счетные камеры, на которых нанесена вытравленная лазером сетка.
Сетка состоит из 9 основных квадратов. Четыре угловых квадрата дополнительно разделены на 16 более мелких квадратов. Центральный квадрат разделен на 25 таких же мелких квадратов, каждый из которых, в свою очередь, разделен на 16 микроквадратов.
С дальнего края каждой камеры расположены отверстия для ввода образца, в которые вносится образец клеток для подсчета.
По обе стороны от счетных камер находятся опоры для установки покровного стекла, на которых лежит кварцевое покровное стекло, обычно на расстоянии около 0.1 mm над счетной камерой.
Поскольку площадь каждого большого квадрата составляет 1 mm2, объем под каждым большим квадратом равен 0.1 mm3 или 1/10 000 мл.
Перед началом подсчета обязательно протрите покровное стекло и счетную камеру этанолом с помощью салфетки Kimwipe, чтобы удалить ворс, отпечатки пальцев или следы воды и высушить поверхность.
Затем аккуратно добавьте небольшое количество воды на каждую из опор для крепления покровного стекла; поверхностное натяжение воды зафиксирует стекло на месте.
Теперь осторожно тритурируйте клеточную суспензию или несколько раз пропустите ее через пипетку, чтобы разрушить клеточные агрегаты. С помощью микропипетки возьмите около 10 μl суспензии и внесите образец в одно из загрузочных отверстий. Раствор будет втягиваться в счетную камеру за счет капиллярного эффекта и должен полностью покрыть сетку.
Пока клетки оседают, выберите объектив. Затем установите гемоцитометр на предметный столик.
Далее рассмотрите клетки под микроскопом. Если в каждом из больших квадратов находится менее 5 клеток, возможно, потребуется снова центрифугировать образец и ресуспендировать осадок в меньшем объеме. Если клетки перекрывают друг друга или расположены слишком плотно, чтобы их можно было легко различить, образец следует развести в большем объеме раствора. Обязательно зафиксируйте коэффициент разведения клеток, так как он понадобится при последующих расчетах.
Теперь можно приступать к подсчету клеток!
Как мы говорили ранее, камера для подсчета покрыта нанесенной лазером сеткой. Линии квадрантов облегчают отслеживание подсчитываемых клеток. Выбирайте размер квадранта для подсчета в зависимости от плотности клеток в вашем образце. Например, если количество клеток мало, подсчитайте все клетки в одном из угловых квадрантов. Для образцов со средним количеством клеток выберите один из 16 меньших квадрантов. При очень высокой плотности клеток подсчитайте клетки в одном из 25 центральных квадрантов. Независимо от выбранного квадранта или плотности клеточного образца, подсчитывайте не менее 20-50 клеток на квадрант.
Не все клетки будут находиться строго внутри квадрантов. Вы можете считать клетки, которые касаются верхней и левой линий, но не учитывайте те, что касаются нижней или правой. Для получения наиболее точного подсчета используйте счетчик клеток для отслеживания и вычислите среднее количество клеток в 4 квадрантах одного размера.
Чтобы рассчитать количество клеток в объеме 1 ml, умножьте количество подсчитанных клеток на 10,000, поскольку, как мы упоминали ранее, каждый большой квадрат на сетке составляет 1/10,000 от ml. Если вы считали один из этих больших квадрантов, просто умножьте это число на 1. Если вы считали один из меньших квадратов в одном из угловых квадрантов, умножьте это число на 16. Если вы считали все клетки в одном из 25 центральных квадрантов, умножьте это число на 25. Если вы разбавляли клеточную суспензию перед заполнением гемоцитометра, вам также потребуется умножить результат на коэффициент разведения.
Затем, чтобы рассчитать количество клеток в 1 ml этого образца, мы умножим 20 клеток в этом центральном квадранте на 10^4 и 25, чтобы получить в итоге 5 x 10^6 клеток в 1 ml образца.
Теперь, когда мы знаем общее количество клеток в 1 ml образца, нам нужно умножить это число на общий объем нашего раствора. Например, если у нас 5 x 10^6 клеток в 1 ml, то в 2 ml будет всего 1 x 10^7 клеток.
Затем, чтобы избежать ошибок из-за неправильного подсчета, неравномерного распределения клеток или ошибок пипетирования, заполните другую сторону камеры и подсчитайте ваш клеточный образец второй раз.
Подсчет клеток под микроскопом также является отличной возможностью оценить жизнеспособность клеток в вашем образце. Для этой цели перед загрузкой в гемоцитометр в образец часто добавляют трипановый синий — витальный краситель.
Живые клетки не пропускают этот краситель, так как они очень избирательны в отношении веществ, проникающих через их мембраны. Однако мертвая клетка не имеет целостной мембраны, что позволяет трипановому синему проникнуть внутрь и окрасить цитоплазму.
Чтобы проверить жизнеспособность вашего образца клеток, разбавьте аликвоту суспензии клеток раствором трипанового синего, а затем загрузите окрашенный образец точно так же, как и обычный образец клеток. При фазово-контрастном освещении живые клетки будут выглядеть светлыми и золотистыми, и именно их следует считать; не считайте тусклые синие мертвые клетки.
Рассчитайте количество клеток, как и прежде, но на этот раз умножьте итоговое число на коэффициент разбавления трипановым синим. Таким образом, если наш исходный репрезентативный образец был предварительно разбавлен трипановым синим, мы бы умножили общее количество клеток на коэффициент разбавления 1:10, что в итоге дало бы 1x108 клеток в нашем образце.
По завершении подсчета не забудьте очистить покровное стекло и счетную камеру!
Теперь, когда вы в совершенстве овладели методом подсчета клеток, давайте обсудим причины, по которым в конкретном эксперименте может потребоваться точно знать количество имеющихся клеток.
После выделения клеток из нормальной или экспериментальной ткани важно знать, сколько клеток было получено. В данном случае исследователям необходимо определить количество спленоцитов, или клеток селезенки, выделенных из селезенки данной мыши.
При проведении эксперимента по изучению взаимодействия двух различных популяций клеток важно знать количество каждого типа клеток, которые смешиваются, как в этом эксперименте по совместному культивированию B- и T-клеток.
Информация о количестве клеток потребуется и для многих других типов клеточных анализов. Здесь подготавливается анализ ELISPOT для определения количества клеток в образце, которые будут секретировать IFNγ (провоспалительный белок) в ответ на воздействие вируса папилломы человека.
При проведении эксперимента, в котором требуется экстрагировать или выделить мРНК из интересующих вас клеток, важно знать исходное количество клеток, чтобы получить достаточное количество мРНК для проведения анализа.
Гемоцитометр — это недорогой и относительно простой в использовании инструмент для подсчета клеток, однако работа с ним может быть трудоемкой и сопряжена с риском человеческой ошибки.
Scepter Handheld Automatic Counter представляет собой, как следует из названия, ручной счетный прибор, который обладает более высокой точностью подсчета по сравнению с гемоцитометром и способен определять как размер, так и объем клеток в образце.
Автоматический счетчик клеток TC10 оценивает как количество, так и жизнеспособность клеток, автоматически рассчитывает общее число клеток в образце, а также позволяет просматривать изображения клеток на экране устройства.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по подсчету клеток. В этом ролике мы рассмотрели: что такое гемоцитометр, как подсчитывать клетки и определять их жизнеспособность, а также основные причины, по которым может возникнуть необходимость в подсчете клеток. Спасибо за просмотр и помните, что синие клетки считать не нужно!
Многие биомедицинские эксперименты требуют манипуляций с точно известным количеством клеток для получения точных, воспроизводимых и статистически знач…
Подсчет клеток является важным этапом во многих анализах с использованием клеточных культур для определения количества и жизнеспособности клеток. В целом, целью подсчета является определение степени разведения образца с неизвестной концентрацией клеток для его дальнейшего использования. Наиболее распространенным лабораторным инструментом для подсчета клеток является гемоцитометр.
Гемацитометр — это инструмент для подсчета, изначально созданный для определения количества клеток крови. В центре гемацитометра расположены две счетные камеры, на которых нанесена вытравленная лазером сетка.
Сетка состоит из 9 основных квадратов. Четыре угловых квадрата дополнительно разделены на 16 более мелких квадратов. Центральный квадрат разделен на 25 таких же мелких квадратов, каждый из которых, в свою очередь, разделен на 16 микроквадратов.
С дальнего края каждой камеры расположены отверстия для ввода образца, в которые вносится образец клеток для подсчета.
По обе стороны от счетных камер находятся опоры для установки покровного стекла, на которых лежит кварцевое покровное стекло, обычно на расстоянии около 0.1 mm над счетной камерой.
Поскольку площадь каждого большого квадрата составляет 1 mm2, объем под каждым большим квадратом равен 0.1 mm3 или 1/10 000 мл.
Перед началом подсчета обязательно протрите покровное стекло и счетную камеру этанолом с помощью салфетки Kimwipe, чтобы удалить ворс, отпечатки пальцев или следы воды и высушить поверхность.
Затем аккуратно добавьте небольшое количество воды на каждую из опор для крепления покровного стекла; поверхностное натяжение воды зафиксирует стекло на месте.
Теперь осторожно тритурируйте клеточную суспензию или несколько раз пропустите ее через пипетку, чтобы разрушить клеточные агрегаты. С помощью микропипетки возьмите около 10 μl суспензии и внесите образец в одно из загрузочных отверстий. Раствор будет втягиваться в счетную камеру за счет капиллярного эффекта и должен полностью покрыть сетку.
Пока клетки оседают, выберите объектив. Затем установите гемоцитометр на предметный столик.
Далее рассмотрите клетки под микроскопом. Если в каждом из больших квадратов находится менее 5 клеток, возможно, потребуется снова центрифугировать образец и ресуспендировать осадок в меньшем объеме. Если клетки перекрывают друг друга или расположены слишком плотно, чтобы их можно было легко различить, образец следует развести в большем объеме раствора. Обязательно зафиксируйте коэффициент разведения клеток, так как он понадобится при последующих расчетах.
Теперь можно приступать к подсчету клеток!
Как мы говорили ранее, камера для подсчета покрыта нанесенной лазером сеткой. Линии квадрантов облегчают отслеживание подсчитываемых клеток. Выбирайте размер квадранта для подсчета в зависимости от плотности клеток в вашем образце. Например, если количество клеток мало, подсчитайте все клетки в одном из угловых квадрантов. Для образцов со средним количеством клеток выберите один из 16 меньших квадрантов. При очень высокой плотности клеток подсчитайте клетки в одном из 25 центральных квадрантов. Независимо от выбранного квадранта или плотности клеточного образца, подсчитывайте не менее 20-50 клеток на квадрант.
Не все клетки будут находиться строго внутри квадрантов. Вы можете считать клетки, которые касаются верхней и левой линий, но не учитывайте те, что касаются нижней или правой. Для получения наиболее точного подсчета используйте счетчик клеток для отслеживания и вычислите среднее количество клеток в 4 квадрантах одного размера.
Чтобы рассчитать количество клеток в объеме 1 ml, умножьте количество подсчитанных клеток на 10,000, поскольку, как мы упоминали ранее, каждый большой квадрат на сетке составляет 1/10,000 от ml. Если вы считали один из этих больших квадрантов, просто умножьте это число на 1. Если вы считали один из меньших квадратов в одном из угловых квадрантов, умножьте это число на 16. Если вы считали все клетки в одном из 25 центральных квадрантов, умножьте это число на 25. Если вы разбавляли клеточную суспензию перед заполнением гемоцитометра, вам также потребуется умножить результат на коэффициент разведения.
Затем, чтобы рассчитать количество клеток в 1 ml этого образца, мы умножим 20 клеток в этом центральном квадранте на 10^4 и 25, чтобы получить в итоге 5 x 10^6 клеток в 1 ml образца.
Теперь, когда мы знаем общее количество клеток в 1 ml образца, нам нужно умножить это число на общий объем нашего раствора. Например, если у нас 5 x 10^6 клеток в 1 ml, то в 2 ml будет всего 1 x 10^7 клеток.
Затем, чтобы избежать ошибок из-за неправильного подсчета, неравномерного распределения клеток или ошибок пипетирования, заполните другую сторону камеры и подсчитайте ваш клеточный образец второй раз.
Подсчет клеток под микроскопом также является отличной возможностью оценить жизнеспособность клеток в вашем образце. Для этой цели перед загрузкой в гемоцитометр в образец часто добавляют трипановый синий — витальный краситель.
Живые клетки не пропускают этот краситель, так как они очень избирательны в отношении веществ, проникающих через их мембраны. Однако мертвая клетка не имеет целостной мембраны, что позволяет трипановому синему проникнуть внутрь и окрасить цитоплазму.
Чтобы проверить жизнеспособность вашего образца клеток, разбавьте аликвоту суспензии клеток раствором трипанового синего, а затем загрузите окрашенный образец точно так же, как и обычный образец клеток. При фазово-контрастном освещении живые клетки будут выглядеть светлыми и золотистыми, и именно их следует считать; не считайте тусклые синие мертвые клетки.
Рассчитайте количество клеток, как и прежде, но на этот раз умножьте итоговое число на коэффициент разбавления трипановым синим. Таким образом, если наш исходный репрезентативный образец был предварительно разбавлен трипановым синим, мы бы умножили общее количество клеток на коэффициент разбавления 1:10, что в итоге дало бы 1x108 клеток в нашем образце.
По завершении подсчета не забудьте очистить покровное стекло и счетную камеру!
Теперь, когда вы в совершенстве овладели методом подсчета клеток, давайте обсудим причины, по которым в конкретном эксперименте может потребоваться точно знать количество имеющихся клеток.
После выделения клеток из нормальной или экспериментальной ткани важно знать, сколько клеток было получено. В данном случае исследователям необходимо определить количество спленоцитов, или клеток селезенки, выделенных из селезенки данной мыши.
При проведении эксперимента по изучению взаимодействия двух различных популяций клеток важно знать количество каждого типа клеток, которые смешиваются, как в этом эксперименте по совместному культивированию B- и T-клеток.
Информация о количестве клеток потребуется и для многих других типов клеточных анализов. Здесь подготавливается анализ ELISPOT для определения количества клеток в образце, которые будут секретировать IFNγ (провоспалительный белок) в ответ на воздействие вируса папилломы человека.
При проведении эксперимента, в котором требуется экстрагировать или выделить мРНК из интересующих вас клеток, важно знать исходное количество клеток, чтобы получить достаточное количество мРНК для проведения анализа.
Гемоцитометр — это недорогой и относительно простой в использовании инструмент для подсчета клеток, однако работа с ним может быть трудоемкой и сопряжена с риском человеческой ошибки.
Scepter Handheld Automatic Counter представляет собой, как следует из названия, ручной счетный прибор, который обладает более высокой точностью подсчета по сравнению с гемоцитометром и способен определять как размер, так и объем клеток в образце.
Автоматический счетчик клеток TC10 оценивает как количество, так и жизнеспособность клеток, автоматически рассчитывает общее число клеток в образце, а также позволяет просматривать изображения клеток на экране устройства.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по подсчету клеток. В этом ролике мы рассмотрели: что такое гемоцитометр, как подсчитывать клетки и определять их жизнеспособность, а также основные причины, по которым может возникнуть необходимость в подсчете клеток. Спасибо за просмотр и помните, что синие клетки считать не нужно!
Подсчет клеток является важным этапом во многих анализах с использованием клеточных культур для определения количества и жизнеспособности клеток. В целом, целью подсчета является определение степени разведения образца с неизвестной концентрацией клеток для его дальнейшего использования. Наиболее распространенным лабораторным инструментом для подсчета клеток является гемоцитометр.
Гемацитометр — это инструмент для подсчета, изначально созданный для определения количества клеток крови. В центре гемацитометра расположены две счетные камеры, на которых нанесена вытравленная лазером сетка.
Сетка состоит из 9 основных квадратов. Четыре угловых квадрата дополнительно разделены на 16 более мелких квадратов. Центральный квадрат разделен на 25 таких же мелких квадратов, каждый из которых, в свою очередь, разделен на 16 микроквадратов.
С дальнего края каждой камеры расположены отверстия для ввода образца, в которые вносится образец клеток для подсчета.
По обе стороны от счетных камер находятся опоры для установки покровного стекла, на которых лежит кварцевое покровное стекло, обычно на расстоянии около 0.1 mm над счетной камерой.
Поскольку площадь каждого большого квадрата составляет 1 mm2, объем под каждым большим квадратом равен 0.1 mm3 или 1/10 000 мл.
Перед началом подсчета обязательно протрите покровное стекло и счетную камеру этанолом с помощью салфетки Kimwipe, чтобы удалить ворс, отпечатки пальцев или следы воды и высушить поверхность.
Затем аккуратно добавьте небольшое количество воды на каждую из опор для крепления покровного стекла; поверхностное натяжение воды зафиксирует стекло на месте.
Теперь осторожно тритурируйте клеточную суспензию или несколько раз пропустите ее через пипетку, чтобы разрушить клеточные агрегаты. С помощью микропипетки возьмите около 10 μl суспензии и внесите образец в одно из загрузочных отверстий. Раствор будет втягиваться в счетную камеру за счет капиллярного эффекта и должен полностью покрыть сетку.
Пока клетки оседают, выберите объектив. Затем установите гемоцитометр на предметный столик.
Далее рассмотрите клетки под микроскопом. Если в каждом из больших квадратов находится менее 5 клеток, возможно, потребуется снова центрифугировать образец и ресуспендировать осадок в меньшем объеме. Если клетки перекрывают друг друга или расположены слишком плотно, чтобы их можно было легко различить, образец следует развести в большем объеме раствора. Обязательно зафиксируйте коэффициент разведения клеток, так как он понадобится при последующих расчетах.
Теперь можно приступать к подсчету клеток!
Как мы говорили ранее, камера для подсчета покрыта нанесенной лазером сеткой. Линии квадрантов облегчают отслеживание подсчитываемых клеток. Выбирайте размер квадранта для подсчета в зависимости от плотности клеток в вашем образце. Например, если количество клеток мало, подсчитайте все клетки в одном из угловых квадрантов. Для образцов со средним количеством клеток выберите один из 16 меньших квадрантов. При очень высокой плотности клеток подсчитайте клетки в одном из 25 центральных квадрантов. Независимо от выбранного квадранта или плотности клеточного образца, подсчитывайте не менее 20-50 клеток на квадрант.
Не все клетки будут находиться строго внутри квадрантов. Вы можете считать клетки, которые касаются верхней и левой линий, но не учитывайте те, что касаются нижней или правой. Для получения наиболее точного подсчета используйте счетчик клеток для отслеживания и вычислите среднее количество клеток в 4 квадрантах одного размера.
Чтобы рассчитать количество клеток в объеме 1 ml, умножьте количество подсчитанных клеток на 10,000, поскольку, как мы упоминали ранее, каждый большой квадрат на сетке составляет 1/10,000 от ml. Если вы считали один из этих больших квадрантов, просто умножьте это число на 1. Если вы считали один из меньших квадратов в одном из угловых квадрантов, умножьте это число на 16. Если вы считали все клетки в одном из 25 центральных квадрантов, умножьте это число на 25. Если вы разбавляли клеточную суспензию перед заполнением гемоцитометра, вам также потребуется умножить результат на коэффициент разведения.
Затем, чтобы рассчитать количество клеток в 1 ml этого образца, мы умножим 20 клеток в этом центральном квадранте на 10^4 и 25, чтобы получить в итоге 5 x 10^6 клеток в 1 ml образца.
Теперь, когда мы знаем общее количество клеток в 1 ml образца, нам нужно умножить это число на общий объем нашего раствора. Например, если у нас 5 x 10^6 клеток в 1 ml, то в 2 ml будет всего 1 x 10^7 клеток.
Затем, чтобы избежать ошибок из-за неправильного подсчета, неравномерного распределения клеток или ошибок пипетирования, заполните другую сторону камеры и подсчитайте ваш клеточный образец второй раз.
Подсчет клеток под микроскопом также является отличной возможностью оценить жизнеспособность клеток в вашем образце. Для этой цели перед загрузкой в гемоцитометр в образец часто добавляют трипановый синий — витальный краситель.
Живые клетки не пропускают этот краситель, так как они очень избирательны в отношении веществ, проникающих через их мембраны. Однако мертвая клетка не имеет целостной мембраны, что позволяет трипановому синему проникнуть внутрь и окрасить цитоплазму.
Чтобы проверить жизнеспособность вашего образца клеток, разбавьте аликвоту суспензии клеток раствором трипанового синего, а затем загрузите окрашенный образец точно так же, как и обычный образец клеток. При фазово-контрастном освещении живые клетки будут выглядеть светлыми и золотистыми, и именно их следует считать; не считайте тусклые синие мертвые клетки.
Рассчитайте количество клеток, как и прежде, но на этот раз умножьте итоговое число на коэффициент разбавления трипановым синим. Таким образом, если наш исходный репрезентативный образец был предварительно разбавлен трипановым синим, мы бы умножили общее количество клеток на коэффициент разбавления 1:10, что в итоге дало бы 1x108 клеток в нашем образце.
По завершении подсчета не забудьте очистить покровное стекло и счетную камеру!
Теперь, когда вы в совершенстве овладели методом подсчета клеток, давайте обсудим причины, по которым в конкретном эксперименте может потребоваться точно знать количество имеющихся клеток.
После выделения клеток из нормальной или экспериментальной ткани важно знать, сколько клеток было получено. В данном случае исследователям необходимо определить количество спленоцитов, или клеток селезенки, выделенных из селезенки данной мыши.
При проведении эксперимента по изучению взаимодействия двух различных популяций клеток важно знать количество каждого типа клеток, которые смешиваются, как в этом эксперименте по совместному культивированию B- и T-клеток.
Информация о количестве клеток потребуется и для многих других типов клеточных анализов. Здесь подготавливается анализ ELISPOT для определения количества клеток в образце, которые будут секретировать IFNγ (провоспалительный белок) в ответ на воздействие вируса папилломы человека.
При проведении эксперимента, в котором требуется экстрагировать или выделить мРНК из интересующих вас клеток, важно знать исходное количество клеток, чтобы получить достаточное количество мРНК для проведения анализа.
Гемоцитометр — это недорогой и относительно простой в использовании инструмент для подсчета клеток, однако работа с ним может быть трудоемкой и сопряжена с риском человеческой ошибки.
Scepter Handheld Automatic Counter представляет собой, как следует из названия, ручной счетный прибор, который обладает более высокой точностью подсчета по сравнению с гемоцитометром и способен определять как размер, так и объем клеток в образце.
Автоматический счетчик клеток TC10 оценивает как количество, так и жизнеспособность клеток, автоматически рассчитывает общее число клеток в образце, а также позволяет просматривать изображения клеток на экране устройства.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по подсчету клеток. В этом ролике мы рассмотрели: что такое гемоцитометр, как подсчитывать клетки и определять их жизнеспособность, а также основные причины, по которым может возникнуть необходимость в подсчете клеток. Спасибо за просмотр и помните, что синие клетки считать не нужно!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a hemacytometer and why is it used for cell counting?
A hemacytometer is a counting chamber with a laser-etched grid originally designed for counting blood cells. It contains two counting chambers with grids divided into quadrants of varying sizes. The tool allows researchers to count cells under a light microscope and calculate total cell concentration, making it essential for determining cell numbers in biomedical experiments requiring known cell quantities.
Q2: How is the hemacytometer grid structured for cell counting?
The hemacytometer grid consists of 9 major quadrants. The four corner quadrants are subdivided into 16 smaller quadrants each, while the central quadrant contains 25 smaller quadrants, each further divided into 16 micro-quadrants. Each large square has an area of 1 mm² and contains a volume of 0.1 mm³, or 1/10,000th of a milliliter, which is critical for calculating total cell concentration.
Q3: What preparation steps are necessary before loading cells into a hemacytometer?
Clean the coverslip and counting chamber with ethanol and a kimwipe to remove lint, fingerprints, and watermarks. Apply water to the coverslip mounting supports to hold the coverslip in place using surface tension. Gently triturate the cell suspension by pipetting up and down to dislodge cell clumps, then aspirate approximately 10 microliters and load it into an introduction port where capillary action draws the solution across the grid.
Q4: How do you choose which quadrant to count based on cell density?
Select quadrant size according to cell density: for low cell numbers, count all cells in one corner quadrant; for medium density, use one of the 16 smaller quadrants; for high density, count cells in one of the 25 central quadrants. Always count at least 20-50 cells per quadrant to ensure accuracy. Count cells touching the top and left lines but disregard those touching bottom or right lines.
Q5: How do you calculate the total number of cells in your sample?
Multiply the cell count by 10,000 (since each large square equals 1/10,000th of a milliliter). Apply a multiplication factor based on quadrant size: multiply by 1 for large quadrants, by 16 for corner quadrants, or by 25 for central quadrants. If you diluted the sample, multiply by the dilution factor. Finally, multiply by total sample volume to determine total cell number in your experimental sample.
Q6: What is trypan blue exclusion and how does it determine cell viability?
Trypan blue is a vital stain that distinguishes live from dead cells. Live cells have intact membranes and exclude the dye, appearing bright and golden under phase contrast microscopy. Dead cells lack membrane integrity, allowing trypan blue to enter and stain the cytoplasm blue. Count only live cells and multiply the final count by the trypan blue dilution factor to determine viable cell concentration in your sample.
Q7: Why is accurate cell counting important in biomedical experiments?
Accurate cell counting ensures reproducible, statistically-relevant data in cell-based assays. Researchers need precise cell numbers when isolating cells from tissue, mixing different cell populations in co-culture experiments, performing immunoassays like ELISPOT, or extracting mRNA from cells. Knowing exact cell quantities allows proper dilution and standardization of experimental conditions across replicates and supports passaging cells cell lines subculturing methods and applications.
Главы в этом видео
0:00
Overview
0:32
Basic Hemacytometer Components
1:49
Basic Operation of the Hemacytometer
3:26
How to Count Cells
6:21
Determining Cell Viability
7:57
Applications
9:53
Summary