Использование гемацитометра для подсчета клеток

Подсчет клеток является важным этапом во многих клеточных анализах для определения количества и жизнеспособности клеток. В целом, цель подсчета состоит в том, чтобы понять, насколько образец неизвестной концентрации клеток должен быть разбавлен для дальнейшего использования. Наиболее распространенным лабораторным инструментом для подсчета клеток является гемацитометр.

Гемацитометр – это счетный инструмент, который изначально был создан для подсчета клеток крови. В центре гемацитометра находятся две счетные камеры, на которых можно найти лазерную вытравленную сетку.

Сетка состоит из 9 основных квадрантов. Четыре угловых квадранта далее разделены на 16 меньших квадрантов. Центральный квадрант разделен на 25 таких меньших квадрантов, каждый из которых в свою очередь разделен на 16 микроквадрантов.

В дальнем конце каждой камеры находятся отверстия для ввода проб, в которые выдается образец клетки, подлежащий подсчету.

По обе стороны от счетных камер находятся монтажные опоры защитного стекла, на которые опирается кварцевый покровный стекло, обычно на высоте около 0,1 мм над счетной камерой.

Поскольку площадь каждого большого квадрата равна 1 мм2, объем, содержащийся в каждом большом квадрате, составляет 0,1 мм3 или 1/10 000 мл.

Перед подсчетом всегда уделите время использованию этанола и салфетки, чтобы очистить и высушить любые ворсинки, отпечатки пальцев или водяные знаки с покровного стекла и счетной камеры.

Затем осторожно добавьте небольшое количество воды в каждую из опор крепления покровного стекла, поверхностное натяжение воды будет удерживать покровное стекло на месте.

Теперь осторожно растирайте клеточную суспензию или пипеткой вверх и вниз, чтобы выбить любые клеточные комки. С помощью микропипетки отасуньте около 10 мкл суспензии, а затем загрузите образец в один из вводных отверстий. Раствор будет втягиваться в счетную камеру капиллярным действием и должен покрывать всю сетку.

Пока ячейки рассаживаются, выберите цель. Затем загрузите гемацитометр на сцену.

Далее рассмотрим клетки под микроскопом. Если в каждом из больших квадрантов менее 5 ячеек, возможно, вам придется снова раскрутить образец и повторно суспендировать гранулу в меньшем объеме. Если ячейки перекрывают друг друга или просто слишком плотные, чтобы их можно было легко отличить друг от друга, возможно, потребуется разбавить образец в большем объеме раствора. Обязательно следите за фактором, с помощью которого вы разбавляете свои клетки. Он понадобится вам при последующих расчетах.

Теперь пришло время посчитать ячейки!

Как мы уже говорили ранее, счетная камера покрыта сеткой, выгравированной лазером. Линии квадрантов облегчают отслеживание ячеек, которые вы подсчитываете. Выберите квадрант размеров для подсчета в зависимости от плотности ячеек в образце. Например, если количество ячеек мало, посчитайте все ячейки в одном из угловых квадрантов. Для образцов со средним количеством ячеек выберите один из 16 меньших квадрантов. Если плотность клеток очень высокая, подсчитайте клетки в одном из 25 центральных квадрантов. Независимо от того, какой квадрант вы выберете, или независимо от плотности образца клеток, подсчитайте не менее 20-50 клеток в одном квадранте.

Не все клетки будут аккуратно попадать в квадранты. Вы можете посчитать ячейки, которые касаются верхней и левой линий, но не обращать внимания на те, которые касаются нижней или правой. Чтобы получить наиболее точный подсчет, используйте счетчик ячеек для отслеживания ячеек и возьмите среднее значение количества ячеек в 4 квадрантах одинакового размера.

Чтобы рассчитать количество клеток в объеме 1 мл, умножьте количество подсчитанных клеток на 10 000, ведь, как мы уже упоминали ранее, каждый большой квадрат на сетке составляет 1/10 000 мл. Если вы посчитали один из этих больших квадрантов, просто умножьте это число на 1. Если вы посчитали один из меньших квадратов в одном из угловых квадрантов, умножьте это число на 16. Если вы посчитали все ячейки в одном из 25 центральных квадрантов, умножьте это число на 25. Если вам довелось разбавить клеточную суспензию перед загрузкой гемациометра, вам также нужно будет умножить на коэффициент разведения.

Затем, чтобы рассчитать количество клеток в 1 мл этого образца, мы умножим 20 клеток в этом центральном квадранте на 104 и 25, чтобы получить в общей сложности 5 x 106 клеток в 1 мл образца.

Теперь, когда мы знаем общее количество клеток в 1 мл образца, нам нужно умножить это число на общий объем нашего раствора. Так, например, если у нас есть 5 x 106 клеток в 1 мл, то в 2 мл у нас будет всего 1 x 107 клеток.

Затем, чтобы избежать ошибок из-за неправильного подсчета, неравномерного распределения клеток или ошибок пипетирования, загрузите другую сторону камеры и подсчитайте образец клеток во второй раз.

Подсчет клеток под микроскопом также является отличным временем для оценки жизнеспособности клеток в вашем образце. Трипановый синий, жизненно важный краситель, часто смешивают с образцом перед загрузкой в гемацитометр для этой цели.

Живые клетки исключают этот краситель, потому что живые клетки очень избирательны в отношении того, что они пропускают через свои мембраны. Мертвая клетка, однако, не имеет интактной мембраны, которая позволяет трипановому синему проходить через цитоплазму и окрашивать ее.

Чтобы проверить жизнеспособность образца клетки, разведите аликвоту клеточной суспензии в трипановом синем, а затем загрузите образец, окрашенный трипановым синим, точно так же, как и обычный образец клетки. При фазовом контрасте живые клетки будут казаться яркими и золотистыми, и их следует подсчитать; Не считайте ни одной тусклой, мертвой, синей клетки.

Рассчитайте количество ячеек, как и раньше, на этот раз умножив итоговое число на коэффициент разбавления трипанового синего. Таким образом, если бы наш первоначальный репрезентативный образец сначала был разбавлен трипановым синим, мы бы умножили общее количество клеток на разведение трипанового синего в соотношении 1:10, что в общей сложности составило 1x108 клеток в нашем образце.

Когда вы закончите подсчет, не забудьте очистить покровную крышку и счетную камеру!

Теперь, когда вы являетесь профессионалом в подсчете клеток, давайте поговорим о некоторых причинах, по которым вам может понадобиться знать, сколько клеток у вас есть в конкретном эксперименте.

После выделения клеток из нормальной или экспериментальной ткани важно знать, сколько клеток вы восстановили. Здесь исследователи захотят узнать, сколько спленоцитов, или клеток селезенки, они выделили из селезенки этой мыши.

Когда вы проводите эксперимент, чтобы увидеть, как реагируют две разные клеточные популяции, важно знать, сколько клеток каждого типа вы смешиваете вместе, как в этом эксперименте с В- и Т-клетками.

Вы захотите узнать, сколько у вас клеток для многих других типов клеточных анализов. В данном случае проводится анализ ELISPOT для определения количества клеток в образце, которые будут секретировать IFNγ, воспалительный белок, в ответ на вирус папилломы человека.

При проведении эксперимента, в котором мРНК должна быть извлечена или выделена из интересующих вас клеток, важно знать, со скольких вызовов вы начинаете, чтобы получить достаточное количество мРНК для эксперимента.

Гемацитометр является недорогим и относительно простым в использовании инструментом для подсчета клеток, но он может быть утомительным и может привести к человеческой ошибке.

Ручной автоматический счетчик Scepter — это, как следует из названия, ручное счетное устройство, которое имеет повышенную точность подсчета по сравнению с гемацитометром и может различать как размер, так и объем клеток в образце клетки.

Автоматический счетчик клеток TC10 оценивает как количество клеток, так и жизнеспособность, автоматически вычисляет общее количество клеток в образце и позволяет просматривать клетки на экране считывания.

Вы только что посмотрели введение JoVE в подсчет клеток. В этом видео мы рассмотрели: что такое гемацитометр, как подсчитывать клетки и определять их жизнеспособность, а также о некоторых причинах, по которым может понадобиться подсчет клеток. Спасибо за просмотр и помните, что синие клетки не считаются!