Пропускание клеток

Пассирование, или субкультивирование, клеток является обычной процедурой, при которой клетки из данной культуры делятся или «расщепляются» на новые культуры и снабжаются свежими средами для облегчения дальнейшей экспансии. Хотя сама концепция относительно проста, в этом видео мы обсудим некоторые из наиболее важных шагов для успешного поддержания и расширения клеточных линий.

Токсичные метаболиты со временем накапливаются в средах клеточных культур. При наращивании клеток особенно важно регулярно менять среду для поддержания здоровья клеток и мониторинга клеточного роста, чтобы избежать чрезмерного роста клеток.

Как правило, субкультивируются два основных типа клеток: иммортализированные клеточные линии и линии стволовых клеток

Иммортализованные клеточные линии — это клетки, которые происходят от многоклеточных организмов, которые испытали некоторый тип мутации, влияющей на регуляцию их клеточного цикла, что позволяет им размножаться бесконечно. Возможно, самой известной иммортализованной клеточной линией является клеточная линия HeLa, которая была получена из поражения рака шейки матки, обнаруженного на биопсии, взятой у г-жи Генриетты Лакс в 1951 году.

В отличие от клеточных линий, увековеченных раком, линии стволовых клеток создаются путем выделения самообновляющихся и мультипотентных клеток из различных тканей как из взрослого, так и из эмбрионального тканевого организма. При правильных условиях эти клетки, как и человеческие эмбриональные стволовые клетки, которые вы видите здесь, могут сохраняться в культуре бесконечно.

Клетки либо оптимально культивируются в суспензии, как иммортализованные клетки, выделенные из крови, либо они лучше всего растут, когда прилипают к поверхности, как это имеет место в случае многих клеток, полученных из тканей.

Рост этих адгезивных клеток должен тщательно контролироваться, чтобы обеспечить их здоровье. В зависимости от типа клеток, большинство адгезивных клеток необходимо пропускать, когда они на 70-90% сливаются, то есть когда они покрывают 70-90% поверхности контейнера с культурой.

Имейте в виду, что клеточные линии сохраняют многие характеристики исходной клеточной культуры, но с каждым последующим пассажем они также могут начать приобретать характеристики, уникальные для расширенной культуры. Поэтому рассмотрите возможность ограничения количества раз, когда вы продолжаете проходить отдельную клеточную культуру.

При прохождении клеток важно использовать стерильную технику и соответствующие реактивы и оборудование.

Важно использовать соответствующие среды для оптимального роста и расширения вашей клеточной линии. Для каждой клеточной линии потребуется определенный коктейль из добавок для роста, однако, большинство клеточных линий, как минимум, нуждаются в добавках со следующим: сывороткой, такой как фетальная сыворотка крупного рогатого скота, которая должна быть подвергнута термической обработке для инактивации бычьего комплемента и которая обеспечивает жизненно важные факторы роста для клеток, антибиотиками, такими как пенициллин и стрептомицин, которые помогают ограничить загрязняющий рост в культуре, и другие факторы роста, такие как фактор роста фибробластов, чтобы помочь продлить рост и расширение клеточных линий. Храните дополненную, или «полную», среду для клеточных культур при температуре 4 °C, когда вы ее не используете.

Во-первых, обратите внимание на цвет среды для тканевых культур. Свежая, клеточная культуральная среда богата питательными веществами и имеет прозрачный, оранжевый цвет, отчасти благодаря добавлению индикатора pH, фенольного красного.

По мере того, как клетки начинают расходовать питательные вещества в среде, отходы и кислоты начинают накапливаться в клеточной культуре, снижая pH. По этой причине многие среды для тканевых культур содержат феноловый красный, который превращает среду из оранжевого в желтый, когда клетки становятся кислыми. Смените носитель, прежде чем он окрасится в этот цвет!

Когда феноловый красный цвет окрашивает среду в розоватый цвет, указывая на то, что pH стал слишком низким для здорового роста клеток, возможно, пришло время сменить резервуар CO2, а также среду.

Большинство адгезивных клеточных линий естественным образом прикрепляются к пластику без покрытия. Поэтому пластиковые планшеты для культивирования клеток, такие как чашки Петри или 6-луночные планшеты, часто используются для субкультивирования клеток.

Также используются пластиковые колбы для клеточных культур. Колба для клеточных культур T25, например, часто используется для расширения популяций малых клеточных линий или для запуска роста медленно расширяющейся клеточной линии. Колбы для культур T75 обычно используются для клеточных линий, которые размножаются быстрее, или для получения большего количества клеток, чем может поместиться в колбе T25.

При удалении адгезивных клеток белки, которые связывают клетки с пластиком, сначала должны быть расщеплены. С этой целью часто используется пищеварительный фермент трипсин. Важно тщательно рассчитать время воздействия трипсина, так как слишком длительное лечение может привести к повреждению других белков клеточной поверхности.

Среды для клеточных культур могут содержать нейтрализаторы трипсина. Поэтому фосфатно-солевой буфер, или PBS, часто используется для промывания клеток перед трипсинизацией.

ЭДТА, хелатор кальция, иногда также используется для усиления протеолитической функции трипсина.

Для расширения клеточной колонии только что пассаженные клетки затем выращивают в инкубаторе для клеточных культур в условиях, соответствующих этой клеточной линии, обычно при температуре около 37 °C, 5% CO2 и влажности 95%.

Прежде чем начать, важно понять, как часто следует контролировать ваши клетки, что будет зависеть от того, насколько быстро ваши клетки размножаются.

Теперь, когда ваша среда имеет счастливый оранжевый цвет, обратите внимание на другие условия культивирования, такие как помутнение культуры или нет, что может указывать на загрязнение, размер и плотность колоний клеток, а также общее качество клеток.

Если слияние клеток достигло примерно 90%, удалите питательную среду для тканей и промойте клетки PBS, не содержащим кальция и магния.

Теперь добавьте в клетки трипсин, а затем инкубируйте их при 37 С. Примерно через 5 минут подтвердите, что клетки оторвались, а затем остановите протеолиз, добавив свежие питательные среды для тканей.

Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку для центрифугирования. Затем, после раскрутки клеток, осторожно удаляют надосадочную жидкость, не нарушая гранулы, и повторно суспендируют клетки в свежих средах. Подсчитайте, сколько клеток вы собрали, а затем засейте клетки в соответствии с плотностью, подходящей для немедленного или последующего расширения.

Теперь, когда вы знаете, как проходить клетки, давайте рассмотрим некоторые различные применения этого метода.

Как упоминалось ранее, человеческие эмбриональные стволовые клетки являются типом клеток, которые должны быть пропущены. Как правило, их совместно культивируют с эмбриональными фибробластами мыши, или МЭФ, которые обеспечивают факторы, помогающие стволовым клеткам сохранять свое плюрипотентное состояние.

Колонии стволовых клеток, выращенные на питающих клетках, должны быть «отобраны», как только они достигнут надлежащей стадии развития. Их можно отбирать с помощью микропипетки или аккуратным соскабливанием с помощью инструмента для сбора стекла, а затем помещать в новую культуру для расширения.

Некоторые клеточные линии чувствительны к ферментативному расщеплению или они настолько плотно прилегают, что не могут быть ресуспендированы только с помощью лечения трипсином. Скребок для клеток можно использовать для аккуратного извлечения клеток со дна культивальной пластины. Если клетки особенно прилипливы, попробуйте двигать серологической пипеткой сильными соскабливающими движениями, промывая дно контейнера с клетками средой или другим подходящим раствором. Будьте осторожны с этим методом, так как нежные клетки могут быть повреждены этим механическим методом диссоциации.

Для более быстрого и воспроизводимого масштабирования экспансии клеток, чем это может быть достигнуто в однослойных колбах, можно использовать многослойные колбы, которые могут расширять клеточные культуры в 3-5 раз по сравнению с однослойными колбами.

Вы только что посмотрели введение JoVE в пассирующие клетки. В этом видео мы рассмотрели, что такое клеточная линия, как ее субкультивировать, а также о некоторых различных применениях пассирующих клеток. Спасибо за просмотр и не забывайте поддерживать актуальность своих медиа!