Пассирование клеток

Пассирование или субкультивирование клеток представляет собой распространенную процедуру, при которой клетки из данной культуры разделяют, или «сплитят», на новые культуры и помещают в свежую среду для дальнейшего наращивания биомассы. Хотя сама концепция относительно проста, в данном видео мы обсудим некоторые из наиболее важных этапов успешного поддержания и экспансии клеточных линий.

С течением времени в средах для культивирования клеток накапливаются токсичные метаболиты. При экспансии клеток особенно важно регулярно менять среду для поддержания жизнеспособности клеток и контролировать процесс экспансии, чтобы избежать избыточного разрастания клеточной массы.

Как правило, субкультивируют два основных типа клеток: иммортализованные клеточные линии и линии стволовых клеток.

Иммортализованные клеточные линии — это клетки, полученные из многоклеточных организмов, в которых произошла мутация, повлиявшая на регуляцию клеточного цикла, что позволило им пролиферировать неограниченно. Пожалуй, самой известной иммортализованной линией является линия клеток HeLa, полученная из очага рака шейки матки при биопсии г-жи Генриетты Лакс в 1951 году.

В отличие от клеточных линий, иммортализованных в результате онкотрансформации, линии стволовых клеток создаются путем выделения самообновляющихся и мультипотентных клеток из различных взрослых и эмбриональных тканей. При соблюдении подходящих условий эти клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки человека, представленные здесь, могут поддерживаться в культуре неограниченно долго.

Клетки либо оптимально культивируются в суспензии, как иммортализованные клетки, выделенные из крови, либо лучше всего растут при прикреплении к поверхности, что характерно для многих клеток, полученных из тканей.

За ростом таких адгезивных клеток необходимо внимательно следить для обеспечения их жизнеспособности. В зависимости от типа клеток, большинство адгезивных клеток следует пересаживать при достижении конфлюэнтности 70-90%, то есть когда они покрывают 70-90% поверхности контейнера для культивирования.

Следует учитывать, что клеточные линии сохраняют многие характеристики исходной клеточной культуры, однако с каждым последующим пассажем они могут начать приобретать характеристики, присущие только экспандированной культуре. Поэтому рекомендуется ограничить количество пассажей для отдельной клеточной культуры.

При пассировании клеток важно соблюдать правила стерильности, а также использовать соответствующие реагенты и оборудование.

Для оптимального роста и экспансии вашей клеточной линии крайне важно использовать подходящие среды. Каждой клеточной линии требуется специфический коктейль добавок для роста, однако большинству линий как минимум необходимы следующие компоненты: сыворотка, например, фетальная бычья сыворотка, которая должна быть подвергнута термообработке для инактивации компонентов комплемента быка и которая обеспечивает клетки жизненно важными факторами роста; антибиотики, такие как пенициллин и стрептомицин, которые помогают ограничить рост контаминантов в культуре; и другие факторы роста, такие как фактор роста фибробластов, которые способствуют продлению роста и экспансии клеточных линий. Храните обогащенную, или «полную», среду для культивирования клеток при 4 C, когда она не используется.

Сначала обратите внимание на цвет среды для культивирования тканей. Свежая среда богата питательными веществами и имеет прозрачный оранжевый цвет, частично благодаря добавлению индикатора pH — фенолового красного.

По мере того как клетки начинают использовать питательные вещества в среде, в клеточной культуре начинают накапливаться продукты метаболизма и кислоты, что приводит к снижению pH. По этой причине многие среды для культивирования тканей содержат феноловый красный, который окрашивает среду из оранжевого в желтый цвет, когда клетки делают культуру кислой. Замените среду до того, как она приобретет этот цвет!

Когда феноловый красный окрашивает среду в розоватый цвет, что указывает на слишком щелочной уровень pH для здорового роста клеток, возможно, пришло время заменить баллон с CO2, а также среду.

Большинство адгезивных клеточных линий естественным образом прикрепляются к необработанному пластику. Поэтому для субкультивирования клеток часто используют пластиковые планшеты для культур клеток, такие как чашки Петри или 6-луночные планшеты.

Также используются пластиковые флаконы для культивирования клеток. Например, флакон T25 часто применяется для экспансии небольших популяций клеточных линий или для запуска роста медленно экспансирующей линии. Флаконы T75 обычно используются для клеточных линий, которые пролиферируют быстрее, или для получения большего количества клеток, чем может поместиться во флаконе T25.

При удалении адгезивных клеток необходимо сначала расщепить белки, которые связывают клетки с пластиком. Для этой цели часто используется пищеварительный фермент трипсин. Важно тщательно контролировать время воздействия трипсина, так как слишком длительная обработка может привести к повреждению других белков клеточной поверхности.

Среды для культивирования клеток могут содержать нейтрализаторы трипсина. Поэтому для промывки клеток перед трипсинизацией часто используют фосфатно-солевой буфер, или PBS.

Для усиления протеолитической функции трипсина иногда также используют EDTA, который является хелатором кальция.

Для экспансии клеточной колонии свежепассированные клетки затем выращивают в инкубаторе для культур клеток в условиях, соответствующих данной клеточной линии, обычно при температуре около 37 C, 5% CO2 и влажности 95%.

Перед началом работы важно определить частоту мониторинга клеток, которая зависит от скорости их пролиферации.

Убедившись, что среда имеет характерный оранжевый цвет, проверьте остальные условия культивирования: нет ли помутнения среды, что может указывать на контаминацию, оцените размер и плотность клеточных колоний, а также общее состояние клеток.

Если клетки достигли примерно 90% конфлюэнтности, удалите среду для культивирования тканей и промойте клетки PBS без кальция и магния.

Добавьте к клеткам трипсин, затем инкубируйте их при 37 C. Примерно через 5 минут убедитесь, что клетки открепились, и остановите протеолиз, добавив свежую среду для культивирования тканей.

Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку для центрифугирования. После осаждения клеток осторожно удалите супернатант, не затрагивая осадок, и ресуспендируйте клетки в свежей среде. Подсчитайте количество собранных клеток, затем проведите посев с плотностью, соответствующей немедленному или последующему экспансии.

Теперь, когда вы знаете, как проводить пассирование клеток, рассмотрим некоторые варианты применения этого метода.

Как упоминалось ранее, эмбриональные стволовые клетки человека относятся к типу клеток, которые необходимо пассировать. Обычно их культивируют совместно с эмбриональными фибробластами мыши (MEF), которые обеспечивают факторы, помогающие стволовым клеткам сохранять свое плюрипотентное состояние.

Колонии стволовых клеток, выращенные на фидерных клетках, необходимо «собирать», когда они достигают соответствующей стадии развития. Их можно отобрать с помощью микропипетки или осторожного соскабливания стеклянным инструментом для сбора, после чего высеять в новую культуру для экспансии.

Некоторые клеточные линии чувствительны к ферментативному перевариванию или настолько плотно прикреплены, что их невозможно ресуспендировать только с помощью трипсина. Для осторожного удаления клеток со дна культуральной чашки можно использовать скребок для клеток. Если клетки обладают особенно сильной адгезией, попробуйте перемещать серологическую пипетку уверенными скребущими движениями, промывая дно контейнера с клетками средой или другим подходящим раствором. Будьте осторожны с этим методом, так как хрупкие клетки могут быть повреждены при таком механическом способе диссоциации.

Для более быстрого и воспроизводимого масштабирования экспансии клеток, чем это возможно в однослойных колбах, можно использовать многослойные колбы, которые позволяют увеличить объем клеточных культур в 3–5 раз по сравнению с однослойными колбами.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по пассированию клеток. В этом видео мы рассмотрели, что представляет собой клеточная линия, как осуществлять ее субкультивирование, а также изучили различные варианты применения пассирования клеток. Спасибо за просмотр и не забывайте обновлять питательную среду!