Микрофлюидный пиколитровый биореактор для микробного анализа одиночных клеток: изготовление, настройка и эксплуатация системы

Общая цель данной процедуры заключается в анализе отдельных бактерий и развивающихся изогенных микроколоний с полным пространственным и временным разрешением в постоянных условиях окружающей среды с использованием микрофлюидного устройства для культивирования. Это достигается путем предварительного проектирования системы микрофлюидного культивирования с помощью программного обеспечения CAD. Затем из полидиметилсилоксана изготавливаются одноразовые микрофлюидные устройства для культивирования, содержащие пиколитровые биореакторы высотой в один микрон для ограничения роста бактерий одним слоем.

Затем микробная культура вводится в микрофлюидное устройство для инокуляции одиночных материнских клеток в биореакторы. Эти клетки экспансируют путем непрерывного введения питательной среды через систему. Результаты получены с помощью автоматизированной таймлапс-микроскопии, демонстрирующей культивирование промышленно значимого штамма Corynebacterium glutamicum, данные о росте и гетерогенность клеток.

В традиционной биотехнологии большинство аналитических методов основано на усредненных данных. Наше микрофлюидное устройство позволяет проводить анализ отдельных бактериальных клеток с пространственным и временным разрешением. Это полезный инструмент для детального изучения гетерогенности клеток в изогенных микроколониях.

Для изготовления одноразовых микрофлюидных устройств с субмикронным разрешением среды мы применяем стандартную фотолитографию с использованием SU-8 и формовку чипов из полидиметилсилоксана. Мы успешно продемонстрировали работу данной технологии на нескольких биотехнологических микроорганизмах, таких как Escherichia coli и Corynebacterium glutamicum. Для начала разработайте конструкцию микрофлюидного устройства с помощью программного обеспечения CAD.

Конструкция, представленная в данном протоколе, состоит из двух впускных отверстий для посева, генератора градиента для смешивания двух различных субстратов, одного выпускного отверстия и шести массивов, каждый из которых содержит пять биореакторов. В чистом помещении подготовьте четырехдюймовую кремниевую пластину и нанесите методом центрифугирования слой фоторезиста SU-8 2000.5 толщиной 1 µm на пластину, как описано в прилагаемом текстовом протоколе. Поместите пластину с покрытием на нагревательную плитку при 95 °C для удаления избытка растворителя, затем поместите первый слой фотомаски, содержащий области захвата пиколитровых реакторов, и пластину с покрытием в установку для совмещения масок.

Затем подвергните подложку экспонированию в режиме вакуумного контакта светом с длиной волны от 350 до 400 нанометров в течение трех секунд при интенсивности 7 mW/cm². Выполните постэкспозиционный прогрев на горизонтальном нагревательном столе при температуре 95 °C для инициирования полимеризации SU-8. После этого поместите подложку в ванну с проявителем SU-8 на одну минуту, а затем перенесите ее во вторую емкость со свежим проявителем SU-8 на несколько секунд.

Промойте пластину в изопропаноле, чтобы удалить проявитель SU-8, и высушите её с помощью потока азота или центрифуги для пластин. Затем подвергните пластину жесткому запеканию в течение 10 минут при 150 °C. Далее сформируйте второй слой, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, чтобы завершить изготовление мастер-формы.

Начните изготовление чипа из PDMS, смешав основу и отвердитель в соотношении 10:1. Дегазируйте смесь PDMS в вакуумном эксикаторе примерно в течение 30 минут до полного исчезновения пузырьков. Затем поместите пластину с SU-8 в форму для литья и залейте на пластину слой смеси PDMS толщиной 3 mm.

Затем запекайте PDMS в течение трех часов при 80 °C в печи. После охлаждения осторожно отделите слой PDMS от подложки и разрежьте его на отдельные чипы с помощью чистого острого скальпеля. Промойте чипы в ванне с н-пентаном в течение 90 минут, после чего проведите две промывки в ацетоне по 90 минут каждая.

Сушите чипы в течение ночи, чтобы удалить остатки растворителя. Непосредственно перед началом эксперимента проколите входные и выходные отверстия в чипе из PDMS с помощью иглы или пробойника, диаметр которого немного меньше диаметра коннекторов, используемых для соединения трубок с чипом из PDMS. Затем осторожно очистите микрофлюидный чип из PDMS изопропанолом и с помощью липкой ленты удалите прилипшие частицы пыли.

Кроме того, предварительно очистите тонкое стеклянное предметное стекло толщиной 170 micron сначала ацетоном, затем изопропанолом, а затем деионизированной водой, и высушите стекло струей азота. После очистки и высушивания подвергните стеклянное стекло и чип из PDMS плазменному окислению в течение 25 секунд при мощности 50 Watts и скорости потока кислорода 20 sccm. Затем аккуратно совместите PDMS и стеклянный чип, после чего наложите PDMS на стекло, что приведет к их склеиванию в течение нескольких секунд.

Закрепите соединение, высушив установку в течение 10 seconds при 80 °C. Чтобы подготовить бактерии для эксперимента на чипе, инокулируйте одну колонию нужного бактериального штамма, например C.glutamicum, в 20 milliliters свежей среды BHI и инкубируйте культуру в течение ночи при 30 °C на ротационном шейкере при 120 RPMs. На следующее утро перенесите 10 microliters стартовой культуры во вторую культуру, содержащую 20 milliliters соответствующей среды, и оставьте клетки расти в течение ночи при тех же условиях.

На следующий день предварительно прогрейте термостат инвертированного микроскопа до 30 °C. В зависимости от конкретной установки это может занять до двух часов. Пока оборудование прогревается, откройте термостат, выберите нужный объектив и подготовьте его с использованием любого необходимого иммерсионного раствора.

Затем установите чип в держатель для чипов и зафиксируйте его. Центрируйте образец под микроскопом и сфокусируйтесь на массивах пиколитровых биореакторов. После фокусировки чипа подсоедините входы и выходы с помощью соответствующих трубок, а затем поместите выходную трубку в резервуар для отходов.

Затем наполните шприц свежей средой, установите его в шприцевой насос и промывайте микрофлюидные каналы в течение одного часа при скорости потока 200 нанолитров в минуту для подготовки чипа. Пока клетки находятся в ранней экспоненциальной фазе роста, перенесите один миллилитр бактериальной культуры в стерильный шприц, заменив шприц и трубку со средой на суспензию клеток и новую трубку. Вводите суспензию клеток в каналы с объемным расходом 200 нанолитров в минуту до тех пор, пока большинство пиколитровых биореакторов не будут заполнены.

Если заполнено лишь небольшое количество биореакторов, увеличьте скорость потока до 800–1200 нанолитров в минуту. После посева необходимого количества клеток отсоедините суспензию клеток, снова подсоедините к чипу питательную среду и проведите перфузию свежей средой со скоростью 100 нанолитров в минуту. Затем просканируйте чип и выберите конкретные биореакторы для таймлапс-визуализации.

Затем настройте последовательность таймлапс-микроскопии для визуализации биореакторов от начала до конца и запустите эксперимент. После того как во всех пиколитровых биореакторах произойдет избыточный рост, остановите эксперимент и утилизируйте чипы соответствующим образом. Чтобы начать анализ, сначала определите, какие биореакторы соответствуют всем требуемым критериям эксперимента, таким как количество и положение материнских клеток.

С помощью программы для анализа, такой как ImageJ, определите скорость роста каждой микроколонии, подсчитав количество клеток в каждой временной точке. Рассчитайте максимальную скорость роста, построив график зависимости времени от логарифма количества клеток. Представленная здесь система может быть применена для изучения различных видов бактерий в отношении различных биологических параметров, таких как рост, морфология или флуоресцентный сигнал.

В данном примере C.glutamicum культивировали в стандартных условиях, и здесь представлены полученные кривые роста трех изогенных микроколоний. Пиколитровые биореакторы также оказались полезными для оценки продукции белка с помощью флуоресцентной микроскопии с временным разрешением (time-lapse), как показано здесь. Подавая на клетки низкую концентрацию индуктора белка IPTG, можно изучить межклеточную вариабельность экспрессии белка на уровне отдельных клеток внутри колоний, произошедших от одной материнской клетки.

Продемонстрированная методика может быть применена для мониторинга и анализа отдельных бактериальных клеток в условиях идеального контроля окружающей среды. Это практически невозможно реализовать с помощью традиционных систем культивирования лабораторного масштаба. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготовить микрофлюидные чипы для культивирования с целью проведения аналогичного анализа единичных клеток.