Микрофлюидный пиколитровый биореактор для микробного анализа одиночных клеток: изготовление, настройка и эксплуатация системы

Общая цель этой процедуры заключается в анализе отдельных бактерий и развивающихся изогенных микроколоний с полным пространственным и временным разрешением при постоянных условиях окружающей среды с использованием микрофлюидного устройства для культивирования. Это достигается путем проектирования микрофлюидной системы выращивания с использованием программного обеспечения CAD. Затем из полидиметилсилоксана изготавливаются одноразовые микрофлюидные устройства для культивирования, которые содержат биореакторы пиколитер высотой в один микрон для ограничения роста бактерий в монослое.

Затем микробная культура вводится в микрофлюидное устройство для инокуляции клеток одной матери в биореакторах. Эти клетки расширяются путем непрерывного вливания питательной среды через систему. Результаты получены с помощью автоматизированной покадровой микроскопии, показывающей культивирование промышленно значимого штамма Corynebacterium glutamicum, данные о росте и межклеточную гетерогенность.

В традиционной биотехнологии большая часть аналитики основана на усредненных данных. Наше устройство для микрофлюидики облегчает анализ отдельных клеток отдельных бактерий с пространственным и временным разрешением. Это полезный инструмент для изучения межклеточной гетерогенности изогенных микроколоний.

Мы применяем обычную фотолитографию SU-8 и литье полидиметилсилоксановых чипов для производства одноразовых микрофлюидных устройств с субмикроразрешением. Мы успешно продемонстрировали нашу технологию на нескольких биотехнических микроорганизмах, таких как кишечная палочка и Corynebacterium glutamicum. Для начала спроектируйте микрофлюидное устройство с помощью программного обеспечения CAD.

Конструкция, представленная в этом протоколе, состоит из двух входных отверстий для посева, градиентного генератора для смешивания двух различных субстратов, одного выходного отверстия и шести массивов, состоящих из пяти биореакторов в каждом. В чистом помещении подготовьте четырехдюймовую кремниевую пластину и нанесите на нее код фоторезиста SU-8 2000.5 на один микрон, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Поместите пластину с покрытием на горячую пластину при температуре 95 градусов Цельсия, чтобы удалить избыток растворителя, а затем вставьте первый слой фотомаски, состоящий из захватывающих областей реакторов пиколитров и пластины с покрытием, внутрь выравнивателя маски.

Затем подвергните пластину в вакуумном контактном режиме воздействию света от 350 до 400 нанометров в течение трех секунд с интенсивностью семь милливатт на квадратный сантиметр. Выполните запекание после выдержки на ровной горячей плите при температуре 95 градусов Цельсия, чтобы инициировать полимеризацию SU-8. Затем поместите пластину в ванну с проявителем SU-8 на одну минуту, а затем переложите пластину во второй контейнер со свежим проявителем SU-8 на несколько секунд.

Промойте пластину в изопропаноле, чтобы удалить проявитель SU-8, и высушите пластину с помощью потока азота или прядильной пластины. Затем вкрутую выпекайте в течение 10 минут при температуре 150 градусов Цельсия. Затем изготовьте второй слой, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, чтобы завершить изготовление мастер-формы.

Начните изготовление чипа PDMS с смешивания основания и носителя в соотношении 10 к одному. Дегазируйте смесь PDMS в течение примерно 30 минут в вакуумном эксикаторе до тех пор, пока все пузырьки не исчезнут. Далее поместите пластину СУ-8 в формовочное устройство и залейте на пластину трехмиллиметровый слой смеси PDMS.

Затем выпекайте PDMS в течение трех часов при температуре 80 градусов Цельсия в духовке. Как только он остынет, осторожно отделите плиту PDMS от пластины и разрежьте плиту на отдельные стружки с помощью чистого и острого скальпеля. Промойте стружку в ванне с н-пентаном в течение 90 минут, а затем две ванночки для мытья ацетоном по 90 минут каждая.

Высушите чипсы в течение ночи, чтобы удалить остатки растворителя. Непосредственно перед экспериментом проделайте входные и выходные отверстия в чипе PDMS с помощью игольчатого или дырокола диаметром чуть меньшего, чем соединители, которые используются для соединения трубок с чипом PDMS. Затем осторожно очистите микрофлюидный чип PDMS изопропанолом и с помощью скотча удалите все прилипшие частицы пыли.

Кроме того, очистите предметное стекло толщиной 170 микрон сначала ацетоном, затем изопропанолом, а затем деионизированной водой, и высушите предметное стекло струей азота. После очистки и высыхания плазма окисляет стеклостек и чип PDMS в течение 25 секунд, используя мощность 50 Вт и скорость потока кислорода 20 кубических см. Затем тщательно выровняйте PDMS и стеклянную стружку, прежде чем поместить PDMS на стекло, что приведет к его склеиванию за считанные секунды.

Закрепите соединение, запекая установку в течение 10 секунд при температуре 80 градусов Цельсия. Чтобы подготовить бактерии к эксперименту с чипами, инокулируйте одну колонию желаемого бактериального штамма, такого как C.glutamicum, в 20 миллилитров свежей среды BHI и инкубируйте культуру в течение ночи при 30 градусах Цельсия на вращающемся вибростенде со скоростью 120 об/мин. На следующее утро перенесите 10 микролитров закваски во вторую культуру, содержащую 20 миллилитров нужной среды, и дайте клеткам вырасти в течение ночи в тех же условиях.

На следующий день прогрейте инкубатор инвертированным микроскопом до 30 градусов по Цельсию. Это может занять до двух часов в зависимости от индивидуальной конфигурации. Пока установка прогревается, откройте инкубатор, выберите нужную цель и подготовьте ее с помощью любого необходимого монтажного носителя.

Затем установите чип внутрь чипхолдера и закрепите его на месте. Центрируйте образец на микроскопе и сфокусируйтесь на массивах биореактора пиколитер. Сфокусировавшись на чипе, соедините входные и выходные отверстия с помощью подходящих трубок, а затем поместите выпускную трубку в резервуар для отходов.

Затем наполните шприц свежей средой, поместите его в шприцевой насос и промойте микрофлюидные каналы в течение одного часа со скоростью потока 200 нанолитров в минуту, чтобы заправить чип. Пока клетки все еще находятся в ранней фазе экспоненциального роста, перенесите один миллилитр бактериальной культуры в стерильный шприц и замените шприц и трубку, содержащие среду, клеточной суспензией и свежей трубкой. Вливайте клеточную суспензию в каналы с объемной скоростью потока 200 нанолитров в минуту до тех пор, пока большая часть биореакторов пиколитер не будет заполнена.

Если заполнено только небольшое количество биореакторов, увеличьте расход до 800-1200 нанолитров в минуту. Когда желаемое количество клеток будет засеяно, отсоедините клеточную суспензию, снова подключите питательную среду к чипу и перфузируйте свежей средой со скоростью 100 нанолитров в минуту. Затем отсканируйте чип и выберите конкретные биореакторы для покадровой визуализации.

Затем настройте последовательность покадровой микроскопии, чтобы получить изображение биореакторов от начала до конца и начать эксперимент. Как только все биореакторы пиколитеров зарастут, остановите эксперимент и выбросьте чипы соответствующим образом. Чтобы начать анализ, сначала определите, какие биореакторы соответствуют всем желаемым критериям эксперимента, таким как количество и положение материнских клеток.

Используя программу анализа, такую как изображение J, определите скорость роста каждой микроколонии, подсчитывая количество клеток в каждой временной точке. Вычислите максимальную скорость роста путем построения графика зависимости времени от логарифма номера ячейки. Представленная здесь система может быть применена для изучения различных видов бактерий в отношении различных биологических параметров, таких как рост, морфология или флуоресцентный сигнал.

В этом примере C.glutamicum культивировали в стандартных условиях культивирования, и здесь показаны результирующие кривые роста, полученные из трех изогенных микроколоний. Биореакторы пиколитер также оказались полезными для получения доступа к производству белка с помощью покадровой флуоресцентной микроскопии, как показано здесь. Подвергая клетки воздействию низкой концентрации индуктора белка IPTG, межклеточные вариации белка могут быть изучены на уровне одной клетки в колониях, начиная с одной материнской клетки.

Продемонстрированный метод может быть применен для мониторинга и анализа отдельных бактериальных клеток с идеальным контролем окружающей среды. Это вряд ли возможно при использовании обычных систем выращивания в масштабе стенда. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить микрофлюидные чипы для культивирования для выполнения сопоставимого анализа одиночных клеток.