Поколение новой дендритно-клеточной вакцины с использованием меланомы и плоскоклеточных раковых стволовых клеток

Общая цель данной процедуры — оценить противоопухолевый иммунитет при применении вакцины на основе дендритных клеток (ДК), полученных из раковых стволовых клеток (РСК), у иммунокомпетентного хозяина. Это достигается путем первоначального выделения алdehyde-дегидрогеназа-положительных (ALDH high) РСК из гетерогенной популяции опухолевых клеток. На втором этапе выделяют ДК из РСК, которые затем подвергают пульсации лизатом для создания вакцины.

Далее нормальным сингенеическим иммунокомпетентным животным вводят вакцину на основе дендритных клеток (DC), пульсированных лизатом CSC или TP DC. Затем, на заключительном этапе, оценивают противоопухолевая эффективность вакцины C-S-C-T-P-D-C. В конечном итоге можно провести анализ ELI SA для оценки анти-CSC иммунитета, индуцированного вакциной C-S-C-T-P-D-C, с помощью Т-клеток и антител реципиента.

Данный проект объединяет две наиболее перспективные области исследований рака: изучение раковых стволовых клеток и иммунотерапию опухолей. Наша лаборатория была одной из первых, кто обнаружил раковые стволовые клетки в солидных опухолях. Именно эти клетки являются «семенами» рака, которые стимулируют его рост, а также метастазирование.

Сегодня вы ознакомитесь с новым подходом к использованию иммунотерапии для специфического воздействия на эти раковые стволовые клетки. Мы используем определенный маркер, называемый альдегиддегидрогеназой, который можно обнаружить с помощью анализа Alde fluoro. Вы увидите, как доктора Лин Лю и Хуон Тау работают совместно с доктором Чоу Ли.

Мы надеемся, что воздействие на эти раковые стволовые клетки позволит улучшить результаты лечения пациентов с различными видами рака. Начните с суспендирования интересующих опухолевых клеток в буфере для анализа Aldefluor в концентрации 1 × 10⁶ клеток/мл. Затем перенесите все клетки, кроме 3 мл, в пробирки с образцами и промаркируйте четыре полистирольные контрольные пробирки размером 12 × 75 мм следующим образом: «неокрашенные», «Aldefluor», «Aldefluor + DEAB» и «7-AAD». Добавьте 1 мл клеточной суспензии в пробирки «неокрашенные» и «7-AAD» и 2 мл в пробирку с Aldefluor.

Затем добавьте 5 µL DEAB в пробирку с ALOR и DEAB. Поместите пробирки на лед, после чего внесите 10 µL активированного субстрата alor в пробирку с alor. Немедленно перенесите 1 mL раствора субстрата в пробирку с ALOR и DEAB, а затем добавьте по 2 µL активированного субстрата alor на 1 миллион клеток в каждую из пробирок с образцами.

Инкубируйте все пробирки в водяной бане при 37 °C в течение 30 минут, затем добавьте 5 µL 7-AAD в пробирку с 7-AAD и 1 µL 7-AAD на 1 миллион клеток в каждую sample-пробирку. Выдержите эти пробирки при 4 °C в течение 10 минут. Центрифугируйте все пробирки в течение 5 минут при 250 ×g при комнатной температуре и ресуспендируйте осадки в буфере для анализа AldeFluor для проведения флуоресцентной сортировки клеток.

Для настройки гейтов сортировки используйте клетки, окрашенные alde Fluor plus DEAB, в качестве отрицательного контроля, и клетки, окрашенные севем A a D, в качестве контроля жизнеспособности. На основании этих контролей установите гейт для выделения alor-положительных клеток A LDH, high D five и SCC семь. Затем используйте его для сортировки клеток образца на популяции alor-положительных A LDH, high D five и SCC семь.

Для получения дендритных клеток сначала выделите бедренные и большеберцовые кости мышей линий C 57 black six и C3 H. Стерилизуйте кости в 75% ethanol в течение одной минуты при комнатной температуре, затем промойте их в HBSS. Далее отсеките концы костей, после чего с помощью шприца объемом 10 мл с иглой 21G промойте костный мозг в чашку Петри; несколько раз аспирируйте и вытесните клетки для создания суспензии одиночных клеток, а затем центрифугируйте их.

Инкубируйте осадок в пяти миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов в течение одной минуты на водяной бане при 37 °C. После подсчета клеток доведите их концентрацию до 1 × 10⁶ клеток на миллилитр в культуральной среде, дополненной G-M-C-S-F и IL-4. Затем культивируйте клетки при 37 °C и 5% CO2, обновляя среду и цитокины через три дня.

На пятый день соберите незрелые дендритные клетки. После центрифугирования клеток ресуспендируйте осадок в 5 мл культурной среды, затем медленно нанесите клеточную суспензию поверх свежеприготовленной среды для изоляции. После повторного центрифугирования соберите дендритные клетки из слоя между культурной средой и средой для изоляции.

Затем после подсчета клеток доведите объем до концентрации 1 × 10⁶ клеток на миллилитр в культуральной среде, дополненной G-M-C-S-F и IL-4; теперь приготовьте лизаты опухолей, подвергнув отсортированные клетки четырем циклам быстрого замораживания-оттаивания с последующим центрифугированием для сбора мембранной фракции лизатов. Затем стимулируйте DCS лизатом, полученным из отсортированных аутологичных клеток A LDH high, для подготовки CSC TPCs.

Для подготовки импульса H-T-P-D-C дендритные клетки (DC) с несортированным лизатом гетерогенных опухолевых клеток вводят экспериментальным животным-реципиентам путем однократной подкожной инъекции 1×10⁶ импульсированных клеток, суспендированных в 100 µL PBS, в левый бок каждой мыши. После вакцинации для создания опухолевого вызова мышам-реципиентам C57BL/6 внутривенно вводят 1×10⁵ гетерогенных опухолевых клеток D5 в 100 µL PBS. Для модели SCC7 мышам-реципиентам C3H проводят подкожное введение 1×10⁶ несортированных опухолевых клеток SCC7 в 100 µL PBS на противоположной стороне от места введения вакцины DC.

Подготовьте суспензию из отдельных клеток селезенок мышей линии C3 H, использованных в качестве реципиентов. Затем активируйте Т- и В-лимфоциты селезенки с помощью иммобилизованных моноклональных антител к CD3 и CD28 в культуральной среде с соответствующим стимулятором. Через четыре дня соберите супернатанты, после чего покройте планшеты для ИФА антителами к интерферону гамма, G-M-CSF или IgG при температуре 4 °C в течение ночи. На следующий день проведите блокировку неспецифического связывания, нанесите на планшет стандарты и собранные супернатанты, затем инкубируйте планшеты при комнатной температуре. После промывки добавьте антитела для детекции, конъюгированные с HRP, на один час, а затем добавьте ТМБ-субстрат.

Наконец, измерьте оптическую плотность на планшетном ридере для ИФА при 450 нанометрах в течение 30 минут после остановки реакции. Alor использовался в качестве маркера для изоляции стволовых клеток при множестве злокачественных новообразований, включая две популяции, обогащенные раковыми стволовыми клетками, D five и SCC seven; в частности, как показано на этих точечных диаграммах, alor-положительные клетки составляют примерно 0,5% и 5,2% в культивируемых клеточных линиях опухолей D five и SCC seven соответственно. Также было установлено, что свежевыделенные опухолевые клетки содержат 2,5% и 4,2% alor-положительных клеток из опухолей D five и SCC seven, созданных in vivo соответственно.

В качестве отрицательного контроля использовали опухолевые клетки, обработанные специфическим ингибитором ЛДГ D-E-A-B-A. Иммуногенность раковых стволовых клеток оценивали путем изучения защитного противоопухолевого иммунитета, индуцированного TPC из CSC, с использованием только что продемонстрированной модели вакцинации. Как показано в этой таблице, у мышей, которым вводили TPC из H, развилось меньше метастазов в легких, чем у мышей, получавших только PBS.

Важно отметить, что у мышей, получавших CSCT PC, наблюдалось еще меньшее количество метастазов в легких, чем у животных, получавших только H-T-P-D-C или PBS. В модели SCC seven нормальные животные C3 H были вакцинированы, как было продемонстрировано выше, по сравнению с контрольной группой. H TPC индуцировали умеренный противоопухолевый иммунитет, в то время как CSC TPC вызывали значительное торможение роста опухоли. Эти результаты указывают на то, что CSC могут быть использованы в качестве более эффективного источника антигенов для нагрузки DC, чем традиционные несортированные опухолевые клетки, для индуцирования защитного иммунитета против воздействия опухолевых клеток.

Для дальнейшего изучения механизмов, лежащих в основе наблюдаемого индуцированного CSC защитного противоопухолевого иммунитета, была проведена активация цитов от животных, вакцинированных DC, и измерение продукции цитокинов методом EISA; как было только что продемонстрировано, продукция цитокинов была значительно выше у цитов, полученных от животных, вакцинированных D five CSC TPCs или S CCC seven CSC PCs, чем у цитов от животных, вакцинированных D five H TPCs или SCC seven HTCs. Сегодня вы ознакомились с тем, как использовать анализ Alor для выделения раковых стволовых клеток.

Эти раковые стволовые клетки могут быть затем использованы для разработки методов иммунотерапии с применением дендритных клеток. Мы надеемся, что такая иммунотерапия, применяемая как самостоятельно, так и в сочетании с существующими методами лечения, улучшит прогноз для пациентов со многими типами рака.