2.7: Бактериальная трансформация: электропорация

Бактериальная трансформация — это естественный процесс, при котором бактерии поглощают чужеродную ДНК, а затем амплифицируют или клонируют ее. В лабораторных условиях этот процесс может быть вызван искусственно, с помощью импульсов электрического поля высокого напряжения для создания пор в мембране бактериальной клетки, через которые может проходить плазмидная ДНК. Электропорация относится к этому методу, и в следующем видео будут продемонстрированы его принципы, пошаговая процедура и применение.

Прежде чем мы поговорим об электропорации бактерий, важно понять тип ДНК, используемый в этих экспериментах: плазмиду. Плазмида — это маленький, круглый, внехромосомный участок ДНК, который действует как вектор, носитель вашей конкретной последовательности ДНК.

Независимо от того, является ли эта последовательность геном флуоресцентного белка у медузы или ферментом из растений, она встраивается в плазмиду через область, называемую сайтом множественного клонирования или MCS. Эта область содержит специфические последовательности, которые расщепляются эндонуклеазами рестрикции или ферментами рестрикции. Те же ферменты рестрикции могут быть использованы для вырезания интересующей вас последовательности таким образом, чтобы концы были комплементарны вновь вырезанным концам плазмиды.

Плазмиды также содержат источник репликации, сокращенно ORI, который указывает на точку, в которой она будет реплицирована. Когда дело доходит до трансформации, ген устойчивости к антибиотикам имеет жизненно важное значение. Как следует из названия, этот ген позволяет бактериям вырабатывать фермент, нейтрализующий антибиотик, что позволяет им выживать в средах, содержащих антибиотики.

При электропорации используется специализированное устройство, называемое электропоратором. Как правило, элементы помещаются в электропорационную кювету, которая имеет электроды с каждой стороны, которые создают электрический контакт с машиной после установки.

Бактериальные клетки, смешанные с ДНК, загружаются в электропорационную кювету, и электрическое поле порядка 1000-10000 вольт на сантиметр прикладывается в течение нескольких миллисекунд. Это приводит к тому, что напряжение на мембране достигает 0,5-1 вольт, что, как полагают, приводит к перестройке бислоя фосполипида, из которого состоит клеточная мембрана, таким образом, что образуются поры. В этом состоянии плазмидная ДНК проходит через мембрану, и когда пульсация завершается, бислой восстанавливается.

Взяв на себя плазмиду, бактерии затем могут расти на агаровых пластинах, содержащих антибиотик.

Теперь, когда мы узнали о плазмидах и механизме электропорации. Давайте рассмотрим, как проводится процедура.

Клетки, которые могут легко поглощать ДНК, называются компетентными клетками. Наиболее распространенным типом компетентных бактерий, которые трансформируются в исследованиях молекулярной биологии, является кишечная палочка, которая является прокариотической бактерией, обитающей в нижнем отделе кишечника. E. coli, которые подготавливаются для электропорации, называются электрокомпетентными клетками.

При работе с бактериями убедитесь, что рабочая зона максимально чиста.

Работа с бактериями также требует практики асептической техники. Как правило, это включает в себя использование горелки Бунзена для стерилизации инструментов и создания конвекционного тока, который удерживает переносимые по воздуху загрязняющие вещества от рабочего места.

Непосредственно перед электропорацией предварительно разогрейте среду до комнатной температуры, доведите агаровые пластины, содержащие антибиотик, до 37°С, и охладите электропорационные кюветы на льду.

Далее разморозьте промытые электрокомпетентные ячейки на льду.

Добавьте 1-5 мкл холодной плазмиды 1 нг/мкл бессолевой холодной плазмиды к бактериальным клеткам, аккуратно перемешайте и добавьте смесь в холодную кювету. Убедитесь, что на улице нет пузырей.

Установите напряжение и напряженность поля электропоратора на правильные настройки для ваших ячеек. Здесь вы видите электропоратор, настроенный на напряжение 1700 вольт и дающий напряженность поля 17 кВ/см.

Вытрите кювету насухо и поместите ее в электропоратор. Пульсируйте ячейками до тех пор, пока не услышите звуковой сигнал.

Неудачная пульсация вызывает электрический разряд, который проявляется в виде видимой искры и слышимого хлопка. Эти выделения, называемые дуговыми дугами, могут быть результатом слишком большого количества соли в ваших компетентных клетках или ДНК.

Успех преобразования можно предсказать, обратив внимание на постоянную времени, которая представляет собой время, необходимое для снижения напряжения после подачи импульса. Когда присутствует соль и раствор для электропорации обладает высокой проводимостью, распад происходит быстро, вызывая разряд и тем самым убивая многие клетки. Для бактерий хорошие временные константы варьируются от 5 до 10 миллисекунд.

Сразу после пульсации извлеките кювету и добавьте 1 мл среды непосредственно в клетки. Эту клетку, содержащую среду, помещают в пробирку и инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа, встряхивая, чтобы клетки восстановились.

Затем, используя асептическую методику, добавляют 20-200 мкл клетки в агаровую пластину, содержащую антибиотик. Переверните пластины так, чтобы агар был сверху и чтобы конденсат не попадал в ваши клетки и инкубируйте в течение ночи при 37°С.

Бактерии, преобразованные с помощью плазмиды, должны образовывать колонии. Подсчитайте колонии и рассчитайте эффективность трансформации, которая представляет собой количество успешных трансформантов, деленное на общее количество пластинчатой ДНК.

Агар и среда, которые обеспечивают питание для бактерий, должны быть предварительно подготовлены и стерилизованы с помощью автоклавирования. Перед использованием дайте жидкой среде остыть до комнатной температуры и дайте агару остыть до 50-55°C – температуры, при которой можно добавлять антибиотик и заливать пластины. Затем дайте пластинам остыть до комнатной температуры для застывания.

Поскольку бактерии, используемые при трансформации, хранятся в морозильной камере, их необходимо сначала разморозить на льду, разложить на агаровой тарелке без антибиотиков, а затем вырастить в течение ночи при температуре 37°C.

Используя асептическую технику, выберите колонию бактерий из агаровой пластины и вырастите ее в более крупной культуре объемом 500 мл в течение ночи при температуре 37°C в встряхивающем инкубаторе.

Пока клетки растут, приготовьте около литра деионизированной воды и сделайте 10% глицерина и воды, объемный раствор. Отавтоклавируйте растворы и дайте им остыть при 4°C.

Измерения абсорбции используются для определения того, находятся ли бактерии в средней логарифмической фазе роста, что означает, что они легко поглощают ДНК. Как только клетки достигнут этой фазы, поместите их на лед и держите там на протяжении всей процедуры.

Затем промойте ячейки, разделив их в двух больших центрифужных пробирках, и вращайте при температуре 4°C, слейте надосадочную жидкость и снова суспендируйте в холодной 100 мл стерильной деионизированной воды. Повторите этот шаг хотя бы еще раз. Целью данного этапа является удаление солей, которые будут сильно влиять на технику электропорации.

Выполните два дополнительных промывки в 50 мл 10% глицерина в воде и, наконец, повторно суспендируйте бактерии в этом же растворе.

Добавьте 50 мкл клеток в несколько пробирок Eppendorf. Теперь эти элементы готовы к использованию в электропорации и должны поддерживаться при температуре 4°C. Или они могут быть мгновенно заморожены и храниться при температуре -80°C.

Как вы сейчас увидите, электропорация имеет множество применений.

Альтернативой электропорации является трансформация с помощью теплового шока, которая основана на воздействии на бактерии хлорида кальция и тепла для введения ДНК в ваши клетки.

В целом, тепловой шок мягче воздействует на бактерии, чем электропорация, и не требует низкого содержания соли. Реакции лигирования, которые включают в себя вставку гена-мишени в плазмиду, могут быть использованы непосредственно для трансформации теплового шока. Трансформация тепловым шоком дешевле, чем электропорация, и не требует дорогостоящего оборудования или кювет. С другой стороны, тепловой шок приводит к более низкой эффективности трансформации, чем электропорация, и занимает больше времени. Также он ограничен бактериальными, дрожжевыми и растительными протопластами, в то время как электропорация может применяться к клеткам млекопитающих.

Здесь вы видите, как эмбриональные фибробласты мыши загружаются в электропорационную кювету. После завершения электропорации эффективность трансформации может быть определена путем наблюдения за степенью, в которой клетки производят зеленый флуоресцентный белок, кодируемый плазмидой. Трансфекция — это термин, обозначающий трансформацию клеток млекопитающих, для которой обычно требуется более низкая напряженность поля, чем у бактериальных клеток, и более высокие временные константы.

Электропорация также может быть выполнена на целых животных, таких как развивающийся куриный эмбрион, который вы видели здесь. Плазмидная ДНК вводится в мозг цыпленка, а затем с помощью электропорационного зонда подается электрическое поле на ткани мозга. Через день или два зеленые и красные флуоресцентные белки, кодируемые плазмидой, вырабатываются нейронами, и ученые могут наблюдать структурные изменения в развивающемся мозге цыплят.

Вы только что посмотрели введение JoVE в бактериальную трансформацию с помощью электропорации. В этом видео плазмида была представлена как наиболее часто трансформируемый тип ДНК, обсуждался биофизический механизм, лежащий в основе электропорации, была показана обобщенная процедура проведения электропорации и описано, как электропорация может быть использована в системе млекопитающих. Спасибо за просмотр!