Бактериальная трансформация: электропорация

Бактериальная трансформация представляет собой естественный процесс, при котором бактерии поглощают чужеродную ДНК с последующим ее амплификацией или клонированием. В лабораторных условиях этот процесс можно вызвать искусственно, используя импульсы электрического поля высокого напряжения для создания пор в мембране бактериальной клетки, через которые может проникнуть плазмидная ДНК. Данный метод называется электропорацией; в следующем видео будут продемонстрированы его принципы, пошаговая процедура и области применения.

Прежде чем перейти к электропорации бактерий, важно понять, какой тип ДНК используется в этих экспериментах: плазмида. Плазмида представляет собой небольшую кольцевую внехромосомную молекулу ДНК, которая служит вектором, то есть носителем вашей специфической последовательности ДНК.

Независимо от того, является ли эта последовательность геном флуоресцентного белка медузы или ферментом растений, она вставляется в плазмиду через область, называемую полилинкером или MCS (multiple cloning site). Эта область содержит специфические последовательности, которые расщепляются рестрикционными эндонуклеазами или рестриктазами. Те же рестриктазы могут быть использованы для вырезания интересующей вас последовательности, чтобы её концы были комплементарны недавно разрезанным концам плазмиды.

Плазмиды также содержат точку начала репликации, сокращенно ORI, которая определяет место, в котором будет происходить репликация. При трансформации жизненно важное значение имеет ген устойчивости к антибиотикам. Как следует из названия, этот ген позволяет бактериям вырабатывать фермент, который нейтрализует антибиотик, обеспечивая их выживание в средах, содержащих антибиотики.

Электропорация осуществляется с помощью специального устройства, называемого электропоратором. Как правило, клетки помещают в кювету для электропорации, которая имеет электроды с каждой стороны, обеспечивающие электрический контакт с прибором после ее установки.

Бактериальные клетки, смешанные с ДНК, загружают в кювету для электропорации и воздействуют электрическим полем напряженностью от 1000 до 10 000 вольт на сантиметр в течение нескольких миллисекунд. Это приводит к тому, что разность потенциалов на мембране достигает 0,5–1 вольта, что, как полагают, вызывает перестройку фосфолипидного бислоя, составляющего клеточную мембрану, и приводит к образованию пор. В этом состоянии плазмидная ДНК проходит через мембрану, а после завершения импульса бислой восстанавливается.

Поглотив плазмиду, бактерии могут затем расти на агариковых пластинах, содержащих антибиотик.

Теперь, когда мы изучили плазмиды и механизм электропорации, давайте рассмотрим, как проводится эта процедура.

Клетки, способные легко поглощать ДНК, называют компетентными клетками. Наиболее распространенным типом компетентных бактерий, трансформируемых в исследованиях по молекулярной биологии, является E. coli — прокариотические бактерии, обитающие в нижних отделах кишечника человека. E. coli, подготовленные для электропорации, называют электрокомпетентными клетками.

При любой работе с бактериями следите за тем, чтобы рабочая зона была максимально чистой.

Работа с бактериями также требует соблюдения правил асептики. Обычно это предполагает использование горелки Бунзена для стерилизации инструментов и создания конвекционного потока, который предотвращает попадание загрязнений из воздуха в рабочую зону.

Непосредственно перед электропорацией прогрейте среды до комнатной температуры, доведите чашки с агаром, содержащим антибиотик, до 37°C и охладите кюветы для электропорации на льду.

Затем разморозьте промытые электрокомпетентные клетки на льду.

Добавьте к бактериальным клеткам 1-5uL холодного бесслезового плазмидного раствора в концентрации 1ng/μL, аккуратно перемешайте и перенесите смесь в холодную кювету. Убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха.

Установите напряжение и напряженность поля электропоратора в соответствии с параметрами для ваших клеток. Здесь вы видите, как электропоратор настраивается на 1700 вольт, что обеспечивает напряженность поля 17kV/cm.

Протрите внешнюю сторону кюветы насухо и поместите ее в электропоратор. Подайте импульс на клетки до тех пор, пока не услышите звуковой сигнал.

Неудачная подача импульса вызывает электрический разряд, который проявляется в виде видимой искры и слышимого щелчка. Этот разряд, называемый пробоем, может быть результатом избыточного содержания солей в компетентных клетках или ДНК.

Успех трансформации можно предсказать по постоянной времени — длительности спада напряжения после подачи импульса. При наличии солей и высокой проводимости раствора для электропорации спад происходит быстро, что вызывает разряд и приводит к гибели многих клеток. Для бактерий оптимальные значения постоянной времени составляют 5-10 миллисекунд.

Сразу после подачи импульса извлеките кювету и добавьте 1 ml среды непосредственно к клеткам. Эту суспензию клеток в среде помещают в пробирку и инкубируют при 37°C в течение 1 часа с перемешиванием для восстановления клеток.

Затем, соблюдая правила асептики, нанесите 20-200uL клеточной суспензии на чашку с агаром, содержащим антибиотик. Переверните чашки агаром вверх, чтобы конденсат не попадал на клетки, и инкубируйте в течение ночи при 37°C.

Бактерии, трансформированные плазмидой, должны образовать колонии. Подсчитайте количество колоний и рассчитайте эффективность трансформации, которая представляет собой число успешно трансформированных клеток, деленное на общее количество высеянной ДНК.

Агар и среды, обеспечивающие питание бактерий, должны быть предварительно подготовлены и стерилизованы в автоклаве. Перед использованием дайте жидким средам остыть до комнатной температуры, а агару — до 50-55˚C (температура, при которой можно добавлять антибиотик и разливать среду по чашкам). Затем дайте чашкам остыть до комнатной температуры для затвердевания.

Поскольку бактерии, используемые для трансформации, хранятся в морозильнике, их необходимо сначала разморозить на льду, высеять на агаризованную среду без антибиотиков и затем культивировать в течение ночи при 37˚C.

Используя асептическую технику, выберите бактериальную колонию с агаризованной среды и вырастите её в большем объеме культуры (500mL) в течение ночи при 37°C в шейкере-инкубаторе.

Пока клетки растут, подготовьте около литра деионизированной воды и приготовьте 10% раствор глицерина в воде (объем к объему). Стерилизуйте растворы в автоклаве и охладите их до 4˚C.

Измерения оптической плотности используются для определения того, находятся ли бактерии в середине логарифмической фазы роста, когда они наиболее охотно поглощают ДНК. Как только клетки достигнут этой фазы, поместите их на лед и держите там на протяжении всей процедуры.

Затем промойте клетки, распределив их по двум большим центрифужным пробиркам, и центрифугируйте при 4°C; слейте супернатант и ресуспендируйте осадок в 100mL холодной стерильной деионизированной воды. Повторите этот шаг еще как минимум один раз. Цель данного этапа — удаление солей, которые могут оказать сильное влияние на процесс электропорации.

Выполните две дополнительные промывки в 50 ml 10% раствора глицерина в воде и в итоге ресуспендируйте бактерии в этом же растворе.

Перенесите по 50μL клеток в несколько пробирок Эппендорфа. Теперь эти клетки готовы к использованию в электропорации и должны храниться при 4˚C. Также их можно подвергнуть шоковой заморозке и хранить при -80˚C.

Как вы увидите далее, электропорация имеет множество областей применения.

Альтернативой электропорации является трансформация методом теплового шока, которая основана на воздействии на бактерии хлорида кальция и температуры для введения ДНК в клетки.

В целом, тепловой шок действует на бактерии более мягко, чем электропорация, и не требует условий с низким содержанием солей. Реакции лигирования, в ходе которых целевой ген встраивается в плазмиду, могут быть использованы непосредственно при трансформации методом теплового шока. Трансформация методом теплового шока дешевле электропорации и не требует дорогостоящего оборудования или кювет. С другой стороны, тепловой шок обеспечивает более низкую эффективность трансформации по сравнению с электропорацией и занимает больше времени. Кроме того, этот метод ограничен бактериями, дрожжами и протопластами растений, в то время как электропорация может быть применена к клеткам млекопитающих.

Здесь показано помещение эмбриональных фибробластов мыши в кювету для электропорации. После завершения электропорации эффективность трансформации можно определить по степени экспрессии клетками зеленого флуоресцентного белка, кодируемого плазмидой. Трансфекцией называют трансформацию клеток млекопитающих, которая обычно требует меньшей напряженности поля, чем при работе с бактериальными клетками, и более высоких постоянных времени.

Электропорация может также проводиться на целых животных, например, на развивающемся эмбрионе цыпленка, которого вы видите здесь. Плазмидная ДНК вводится в мозг цыпленка, после чего с помощью зонда для электропорации на ткани мозга воздействуют электрическим полем. Через день или два нейроны начинают синтезировать зеленый и красный флуоресцентные белки, кодируемые плазмидой, что позволяет ученым наблюдать структурные изменения в развивающемся мозге цыпленка.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по бактериальной трансформации методом электропорации. В этом видео плазмида была представлена как наиболее распространенный тип трансформируемой ДНК, обсуждался биофизический механизм, лежащий в основе электропорации, была продемонстрирована общая процедура проведения электропорации и описано, как электропорация может быть использована в системах млекопитающих. Спасибо за просмотр!