Бактериальная трансформация: электропорация

Бактериальная трансформация представляет собой естественный процесс, при котором бактерии поглощают чужеродную ДНК с ее последующим усилением или клонированием. В лабораторных условиях этот процесс можно индуцировать искусственно, используя импульсы электрического поля высокого напряжения для создания пор в мембране бактериальной клетки, через которые может пройти плазмидная ДНК. Этот метод называется электропорацией; в следующем видео будут продемонстрированы его принципы, пошаговая процедура и применение.

Прежде чем перейти к электропорации бактерий, важно разобраться в типе ДНК, используемой в этих экспериментах: плазмиде. Плазмида представляет собой небольшой кольцевой внехромосомный фрагмент ДНК, который служит вектором, то есть носителем вашей специфической последовательности ДНК.

Будь то ген флуоресцентного белка медузы или фермент растений, эта последовательность встраивается в плазмиду через область, называемую полилинкером или множественным сайтом клонирования (MCS). Эта область содержит специфические последовательности, которые расщепляются рестрикционными эндонуклеазами или рестриктазами. Те же рестриктазы могут быть использованы для вырезания интересующей вас последовательности, чтобы её концы были комплементарны вновь разрезанным концам плазмиды.

Плазмиды также содержат точку начала репликации (ORI), которая определяет место, где будет происходить репликация. При проведении трансформации критически важным является ген устойчивости к антибиотикам. Как следует из названия, этот ген позволяет бактериям вырабатывать фермент, нейтрализующий антибиотик, что обеспечивает их выживание в средах, содержащих антибиотики.

Для электропорации используется специализированное устройство, называемое электропоратором. Обычно клетки помещают в кювету для электропорации, имеющую электроды с каждой стороны, которые устанавливают электрический контакт с прибором после ее установки.

Бактериальные клетки, смешанные с ДНК, загружают в кювету для электропорации и на несколько миллисекунд прикладывают электрическое поле напряженностью от 1000 до 10 000 вольт на сантиметр. Это приводит к тому, что разность потенциалов на мембране достигает 0,5–1 вольт, что, как считается, вызывает перестройку фосфолипидного бислоя клеточной мембраны и приводит к образованию пор. В этом состоянии плазмидная ДНК проходит сквозь мембрану, а после завершения импульса бислой восстанавливается.

После поглощения плазмиды бактерии могут расти на чашках с агаром, содержащим антибиотик.

Теперь, когда мы изучили плазмиды и механизм электропорации, давайте рассмотрим, как проводится эта процедура.

Клетки, способные легко поглощать ДНК, называют компетентными клетками. Наиболее распространенным типом компетентных бактерий, используемых для трансформации в молекулярно-биологических исследованиях, является E. coli — прокариотические бактерии, обитающие в нижних отделах кишечника человека. E. coli, подготовленные для электропорации, называют электрокомпетентными клетками.

При работе с бактериями следите за тем, чтобы рабочая зона была максимально чистой.

Работа с бактериями также требует соблюдения правил асептики. Обычно это предполагает использование горелки Бунзена для стерилизации инструментов и создания конвекционного потока, который предотвращает попадание загрязняющих веществ из воздуха в рабочую зону.

Непосредственно перед электропорацией доведите питательную среду до комнатной температуры, прогрейте чашки с агаром, содержащим антибиотик, до 37°C, и охладите кюветы для электропорации на льду.

Затем разморозьте промытые электрокомпетентные клетки на льду.

Добавьте к бактериальным клеткам 1-5uL охлажденной безсолевой плазмиды в концентрации 1ng/μL, осторожно перемешайте и перенесите смесь в охлажденную кювету. Убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха.

Установите напряжение и напряженность поля электропоратора в соответствии с параметрами для ваших клеток. Здесь вы видите, как электропоратор настраивают на 1700 вольт, что обеспечивает напряженность поля 17kV/cm.

Протрите внешние стенки кюветы насухо и поместите её в электропоратор. Подайте импульс на клетки до тех пор, пока не услышите звуковой сигнал.

Неудачный импульс приводит к электрическому разряду, который проявляется в виде видимой искры и слышимого щелчка. Этот разряд, называемый пробоем, может быть следствием слишком высокого содержания солей в компетентных клетках или ДНК.

Успех трансформации можно предсказать по постоянной времени — длительности спада напряжения после подачи импульса. При наличии солей, когда раствор для электропорации обладает высокой проводимостью, спад происходит быстро, что вызывает разряд и, следовательно, гибель многих клеток. Для бактерий оптимальные значения постоянной времени составляют 5-10 milliseconds.

Сразу после подачи импульса извлеките кювету и добавьте 1 ml питательной среды непосредственно к клеткам. Эту суспензию клеток в среде помещают в пробирку и инкубируют при 37°C в течение 1 часа с перемешиванием для восстановления клеток.

Затем, соблюдая правила асептики, нанесите 20-200uL суспензии клеток на чашку с агаром, содержащим антибиотик. Переверните чашки агаром вверх, чтобы конденсат не попадал на клетки, и инкубируйте в течение ночи при 37°C.

Бактерии, трансформированные плазмидой, должны образовать колонии. Подсчитайте количество колоний и рассчитайте эффективность трансформации, которая представляет собой число успешно трансформированных клеток, деленное на общее количество высеваемой ДНК.

Агар и среды, обеспечивающие питание бактерий, должны быть заранее подготовлены и стерилизованы в автоклаве. Перед использованием дайте жидким средам остыть до комнатной температуры, а агару — до 50-55˚C; при этой температуре можно добавлять антибиотик и разливать среду по чашкам. Затем дайте чашкам остыть до комнатной температуры для затвердевания.

Поскольку бактерии, используемые для трансформации, хранятся в морозильнике, их необходимо сначала разморозить на льду, посеять на агаризованную среду без антибиотиков и оставить на ночь для роста при 37˚C.

Используя асептическую технику, выберите бактериальную колонию с агаровой чашки и вырастите её в большем объеме (500mL культуры) в течение ночи при 37°C в шейкере-инкубаторе.

Пока клетки растут, подготовьте около одного литра деионизированной воды и приготовьте 10% раствор глицерина в воде (v/v). Стерилизуйте растворы в автоклаве и охладите их до 4˚C.

Измерения абсорбции используются для определения того, находятся ли бактерии в средней логарифмической фазе роста, при которой они легко поглощают ДНК. Как только клетки достигнут этой фазы, поместите их на лед и держите там на протяжении всей процедуры.

Затем промойте клетки, разделив их по двум большим центрифужным пробиркам, и центрифугируйте при 4°C; слейте супернатант и ресуспендируйте осадок в 100mL холодная стерильной деионизированной воды. Повторите этот шаг как минимум еще один раз. Целью данного этапа является удаление солей, которые окажут сильное влияние на процесс электропорации.

Выполните еще две промывки в 50 ml 10% раствора глицерина в воде и в итоге ресуспендируйте бактерии в этом же растворе.

Разлейте по 50μL клеток в несколько пробирок Эппендорфа. Теперь эти клетки готовы к использованию в электропорации; их следует хранить при 4˚C либо подвергнуть быстрому замораживанию и хранить при -80˚C.

Как вы скоро увидите, электропорация имеет множество областей применения.

Альтернативой электропорации является трансформация методом теплового шока, которая основана на воздействии на бактерии хлорида кальция и тепла для введения ДНК в клетки.

В целом, тепловой шок действует на бактерии мягче, чем электропорация, и не требует условий низкой солености. Реакции лигирования, включающие вставку целевого гена в плазмиду, могут быть использованы непосредственно при трансформации методом теплового шока. Трансформация методом теплового шока дешевле электропорации и не требует дорогостоящего оборудования или кювет. С другой стороны, тепловой шок обеспечивает более низкую эффективность трансформации по сравнению с электропорацией и занимает больше времени. Кроме того, этот метод ограничен бактериями, дрожжами и протопластами растений, в то время как электропорация может применяться к клеткам млекопитающих.

Здесь вы видите, как эмбриональные фибробласты мыши помещаются в кювету для электропорации. После завершения электропорации эффективность трансформации можно определить по степени экспрессии клетками зеленого флуоресцентного белка, закодированного плазмидой. Трансфекция — это термин, используемый для трансформации клеток млекопитающих, которая обычно требует меньшей напряженности поля, чем клетки бактерий, и больших постоянных времени.

Электропорацию также можно проводить на целых животных, например, на развивающемся эмбрионе цыпленка, которого вы видите здесь. Плазмидная ДНК вводится в мозг цыпленка, после чего с помощью электрода для электропорации на ткани мозга воздействуют электрическим полем. Через день или два нейроны начинают синтезировать зеленый и красный флуоресцентные белки, закодированные плазмидой, что позволяет ученым наблюдать структурные изменения в развивающемся мозге цыпленка.

Вы только что посмотрели вводный видеокурс JoVE по бактериальной трансформации методом электропорации. В этом видео плазмида была представлена как наиболее часто трансформируемый тип ДНК, обсуждался биофизический механизм, лежащий в основе электропорации, была показана общая процедура проведения электропорации и описано, как электропорация может быть использована в системах млекопитающих. Спасибо за просмотр!