Очистка плазмидной ДНК

Плазмиды представляют собой кольцевые внехромосомные молекулы ДНК, которые в молекулярной биологии выполняют роль носителей или векторов для определенного фрагмента ДНК. Для репликации плазмид используются бактерии, что позволяет массово производить интересующую исследователя ДНК. Процесс, с помощью которого исследователи выделяют плазмиды из бактерий, называется очисткой плазмид; этот процесс будет подробно описан в данном видео.

Очевидно, что очистка плазмид подразумевает выделение плазмид, но что именно это означает? Для очистки плазмид их необходимо изолировать от бактериальной хромосомы, белков, бактериальной мембраны и бактериальных рибосом.

Несмотря на существование множества различных наборов для очистки плазмид, основной принцип очистки остается неизменным для всех. Сначала выбранная бактериальная колония выращивается в подходящей культурной среде, содержащей соответствующие антибиотики. Благодаря гену устойчивости к антибиотикам, закодированному в плазмиде, в этой среде будут расти только бактерии, содержащие плазмиду. Бактерии собирают и подвергают лизису при высоком значении pH. Затем pH нейтрализуют, добавляют соль, после чего смесь центрифугируют для удаления клеточного дебриса и геномной ДНК.

Нейтрализованный клеточный лизат наносят на силикатную колонку. Считается, что плазмидная ДНК прикрепляется к колонке посредством механизма, называемого анионным обменом, при котором ДНК, являясь сильным анионом, связывается с отрицательно заряженной колонкой через катионный солевой мостик. Другие компоненты лизата, такие как белки, вымываются из колонки буферами с высокой концентрацией соли. Наконец, очищенная плазмида высвобождается из колонки при добавлении буфера с низкой концентрацией соли, который разрушает солевой мостик.

При выполнении данной процедуры следует использовать лабораторный халат, одноразовые перчатки и защитные очки.

Бактериальные культуры, трансформированные нужной плазмидной ДНК, следует выращивать в течение ночи в питательной среде с соответствующим антибиотиком в инкубаторе с перемешиванием при 37°C.

На следующий день бактериальную культуру осаждают путем центрифугирования, после чего супернатант удаляют. Оставшийся осадок ресуспендируют в лизирующем буфере.

После ресуспендирования бактерии можно перенести в пробирку меньшего объема, куда добавляют лизирующий буфер. Лизирующий буфер имеет высокий pH и содержит детергенты, такие как додецилсульфат натрия, которые разрушают бактериальные мембраны, вызывая лизис бактерий. При добавлении лизирующего буфера раствор станет мутным, а после перемешивания — более прозрачным. Смесь нельзя подвергать вортексированию из-за возможности сдвигового разрушения геномной ДНК, которая может загрязнить очищенную плазмидную ДНК.

Затем добавляют нейтрализующий буфер, чтобы нейтрализовать щелочную среду и снизить pH. При осторожном перемешивании геномная ДНК, а также связанные с ней белки выпадают в осадок, в то время как плазмидная ДНК остается в растворе. Снова избегайте вортексирования, чтобы ваши плазмиды были свободны от загрязнения геномной ДНК.

Затем смесь центрифугируют, осаждая преципитат из геномной ДНК и белков. Супернатант содержит плазмидную ДНК и растворимые белки.

Этот супернатант переносят на колонку путем декантирования (простого сливания) или с помощью пипетки. Осадок можно утилизировать.

Затем через колонку пропускают промывочный буфер с высоким содержанием соли, при этом ДНК остается связанной с силикагелем. Повторные стадии промывки буфером с высоким содержанием соли удаляют эндонуклеазы, РНК, белки, красители и низкомолекулярные примеси. Проскок после стадий промывки следует утилизировать. После финальной стадии промывки убедитесь, что фильтр полностью сухой и в нем не осталось буфера. Плазмидная ДНК по-прежнему находится на фильтре.

Плазмидную ДНК элюируют стерильной водой или элюирующим буфером. Полученная ДНК готова к немедленному использованию в широком спектре приложений.

Существует несколько способов проверить чистоту плазмид после очистки. С помощью спектрометра можно сравнить абсорбцию на разных длинах волн для определения концентрации плазмидной ДНК. Анализ очищенной плазмиды с помощью агарозного геля позволяет определить, соответствует ли плазмида нужному размеру и отсутствуют ли загрязнения. Этот этап гарантирует отсутствие загрязнения геномной ДНК и подтверждает, что плазмида не была модифицирована в бактериях.

Процедуру очистки плазмид можно модифицировать в зависимости от размера плазмид, их копийности, объема культуры; также могут использоваться различные приборы для этапов связывания, промывки и элюции. Выход продукта является одним из наиболее существенных различий между способами выделения плазмид, поэтому в зависимости от требуемого количества их часто разделяют на мини-препарацию (мини-преп), миди-препарацию (миди-преп), макси-препарацию (макси-преп) и мега-препарацию (мега-преп).

Что касается последующего применения, одной из процедур, которая обычно следует за очисткой плазмид, является трансфекция, заключающаяся во введении плазмидной ДНК в эукариотические клетки. Часто целью эксперимента по трансфекции является визуализация структуры клеток и тканей с помощью репортерных белков, таких как белки, маркирующие нейроны на представленных здесь изображениях.

Иногда в одни и те же бактерии можно ввести несколько плазмид, очищенных с помощью различных методов препарации, тем самым воспроизводя целый биосинтетический путь за счет продукции ряда ферментов, кодируемых этими плазмидами. Конечным результатом является синтез клеткой сложного соединения, такого как антибиотик, показанный здесь.

Очищенные плазмиды могут быть повторно введены в бактерии для получения больших количеств белка, кодируемого плазмидой. Здесь показаны бактериальные клетки, которые подвергаются гомогенизации и лизису перед проведением аффинной очистки для выделения целевого белка. Очищенный белок кристаллизуют, после чего определяют его структуру.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по очистке плазмид. В этом ролике мы обсудили основные принципы данного метода, пошаговое описание процедуры и ряд вариантов применения полученного препарата плазмид. Как всегда, спасибо за просмотр!