Быстрый и эффективный метод оценки патогенности Ustilago maydis на линиях кукурузы и teosinte

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы инокулировать с помощью иглы культуру суспензии клеток мауса USTA Lago и провести скрининг реакции на устойчивость к болезням пересекающихся линий лабиринта тете и лабиринта теосинте. Это достигается путем предварительного выбора производственных линий для инокуляции и просеивания. Далее высаживаются семена для экспериментальных и контрольных экспериментов по инъекционной инокуляции.

Через 10 дней в стебель каждого растения вводится суспензия U-образных клеток. Наконец, сравниваются реакции сопротивления опытных и контрольных растений. В конечном счете, можно получить результаты, которые покажут успешную инокуляцию с помощью инъекции иглой за счет визуализации фенотипа растения, которое было привито вами. Маис.

Главное преимущество этой методики заключается в том, что она доставляет возбудителя непосредственно между листьями. Это устраняет проблему проникновения патогена. Чтобы начать отбор линий растений для инокуляции и скрининга, как показано здесь, для этого исследования были использованы две линии лабиринта, пять линий теосинте и 40 лабиринтов линий теосинте с нехарактерной устойчивостью к U Mais.

Посадите по четыре семени каждой линии растений в небольшие плоские места, протолкнув семена пальцем примерно на полдюйма в почву и слегка засыпав их почвой. Затем поместите растения в камеру роста и полейте семена до полного замокнуть, следя за тем, чтобы они остались под почвой после полива. Выращивайте растения при дневной и ночной температуре 28 и 20 градусов по Цельсию и 14 и 10 часовых циклах света и темноты соответственно.

И примерно 500 микромоляров на квадратный метр в секунду фотосинтетически активного излучения в верхней части купола. Поддерживайте относительную влажность в течение дня и ночи на уровне примерно 70% и 90% соответственно и держите все растения в одной камере для выращивания, чтобы поддерживать благоприятную среду для роста на протяжении всего эксперимента. Через восемь дней после посадки семян используйте стерильную петлю для высадки хёйса из замороженного глицеринового бульона на картофельный декстрозный агар или планшеты PDA, инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух дней и регулярно контролируйте его, чтобы убедиться, что он хорошо растет под ламинарным колпаком.

С помощью стерильной зубочистки выберите одну колонию для каждого штамма и поместите их в три миллилитровые пробирки с бульоном PD. Инкубируйте культуры при температуре 30 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту в течение двух дней, периодически проверяя на рост. Затем измерьте внешний диаметр 600 культур, чтобы убедиться, что они были выращены с наружным диаметром 1,0.

С помощью воды доведите культуры до конечной концентрации 1 миллион клеток на миллилитр в конечном объеме 30 миллилитров. Такая концентрация суспензии патогенных клеток неизменно приводит к хорошему заражению растений. Затем перед инокуляцией смешайте равные объемы двух штаммов, которые вы сделали в качестве штаммов.

Перед тем как наполнить трехмиллилитровый шприц клеточной суспензией, наполните контрольный шприц водой для инъекции с минимальным ущербом для растения. Ткань прикрепляет нулевую точку 457 миллиметра на 1,3 сантиметра иглой для подкожных инъекций к концу каждого шприца. Извлеките растения из камеры роста и внесите под углом 90 градусов чуть выше линии почвы.

Осторожно вставьте иглу U maus в стебель экспериментального растения, пока она не окажется в середине стебля. Введите примерно 100 микролитров клеточной суспензии. Он будет проталкиваться через стебель и будет виден, когда будет двигаться в водоворот растения.

Продолжайте вводить дополнительные экспериментальные растения до тех пор, пока шприцы не опустеют. Затем наполните его водой, чтобы очистить иглу от любой растительной ткани и снова наполните шприц до тех пор, пока не будут введены все растения. Используйте водяной шприц для введения контрольных растений аналогичным образом.

Когда инъекции завершены. Ежедневно помещайте растения обратно в камеру для выращивания. Поливайте только почву и проверяйте развитие патогенов и реакции устойчивости растений.

Используя оценку реакции от одного до пяти, шкалируйте, оценивайте и записывайте реакции устойчивости для каждого растения через 7, 10, 14 и 21 день после инокуляции или DPI. Числовые значения на шкале оценки увеличиваются с увеличением тяжести заболевания. Например, реакция сопротивления A1C на один А или два сопротивления указывает на сопротивление.

Реакция трех, четырех или пяти резистентностей указывает на восприимчивость. Сравните реакции сопротивления экспериментальных и контрольных установок и выберите экспериментальные установки с рейтингом реакции сопротивления A1C один, а два раза. Эти растения считаются устойчивыми к матису.

В этом эксперименте большинство растений, инокулированных перегноем, были восприимчивы к инфекции. У растений наблюдалось тяжелое развитие болезни, проявляющееся в образовании стеблевых и прикорневых галлов с черными спорами телио. Несколько растений погибли после прививки из-за тяжести заболевания.

В отличие от этого, контрольные растения были очень чистыми и не показали развития патогена ни на одной части растения, что указывает на то, что развитие патогена на экспериментальных растениях произошло из-за инокуляции иглой U Mais Были идентифицированы три линии перекрестной агрессии Mais Teosinte, которые были устойчивы к U Mais, и успешная инокуляция была подтверждена по незначительному склерозу. голубой цвет в производстве, или незначительное образование галлов листьев. Этот метод может быть выполнен высокоэффективным и воспроизводимым способом. Это помогает в инокуляции и фенотипировании большого количества растений.