Стволовые Программирование Клетки для терапевтической ангиогенеза Использование биоразлагаемых полимерных наночастиц
27 сентября 2013 г.
Мы описываем метод программирования стволовых клеток сверхэкспрессировать лечебных факторов для ангиогенеза помощью биоразлагаемых полимерных наночастиц. Процессы, описанные включают синтез полимера, трансфекции полученных из жировой ткани стволовые клетки в пробирке, и проверки эффективности запрограммированными стволовых клеток стимулировать ангиогенез в мышиной ишемии задней конечности модели.
Общая цель данной процедуры — продемонстрировать использование полимерных наночастиц для гиперэкспрессии терапевтических генов в стволовых клетках с использованием модели ишемии задней конечности у морских организмов. Это достигается путем первоначального синтеза биоразлагаемых полимеров посредством двухэтапной реакции микронного смешивания с последующим созданием полимерных наночастиц, кодирующих терапевтические гены. Вторым этапом является трансфекция стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека, in vitro для гиперэкспрессии фактора роста эндотелия сосудов.
Затем программированные стволовые клетки вводят внутримышечно в ишемизированную заднюю конечность для продукции терапевтических факторов. Заключительным этапом является мониторинг выживаемости клеток и реперфузии крови в ишемизированной конечности в течение определенного времени с помощью биолюминесцентной визуализации и лазерной допплеровской визуализации. В конечном итоге можно провести количественный анализ экспрессии генов и гистологическое исследование, чтобы продемонстрировать локальную экспрессию терапевтических факторов и эффективность регенерации тканей.
Преимущество данного метода по сравнению с традиционными способами стимуляции ангиогенеза заключается в использовании стволовых клеток в качестве средств доставки лекарственных препаратов. Эта стратегия позволяет использовать естественную способность стволовых клеток к хомингу — миграции в зону ишемии, а также обеспечивает динамический ответ на сигналы микроокружения. Наночастицы, используемые для доставки плазмидной ДНК, обладают высокой эффективностью и биоразлагаемостью, что обеспечивает более низкую цитотоксичность и доставку большего количества копий ДНК внутрь клеток.
Данный метод может быть применен для многих клинически значимых терапевтических препаратов на основе клеток, поскольку в нем используется биоразлагаемый невирусный вектор для вставки генов в аутологичные клетки. Работая в вытяжном шкафу, отвесьте бутан-диаль DLI и перенесите материал в стеклянный флакон для ингаляций с магнитным перемешивателем. Затем добавьте в этот же флакон предварительно нагретый пятиамино-1-пентол. Немедленно поместите флакон на магнитную мешалку и установите скорость 600 RPM.
Перенесите флакон в печь, нагретую до 90 °C, и через четыре часа увеличьте скорость перемешивания до 1000 RPM, затем снизьте скорость до 300 RPM и перемешивайте еще в течение 12–16 часов. Затем добавьте 10 мл безводного тетрагидрофурана к 5 г C 32 в стеклянный флакон с магнитным перемешивателем. Обернув флакон фольгой, подвергните содержимое интенсивному воздействию вортекса до полного растворения; после этого в отдельный стеклянный флакон с магнитным перемешивателем добавьте 10 мМ тетраэтиленгликольдиамина.
Добавьте 40 milliliters THF в этот флакон; поместите оба флакона на магнитную мешалку на пять минут, прежде чем смешивать их. Накройте полученную смесь фольгой и оставьте ее перемешиваться при комнатной температуре в течение 24 часов. Конечный продукт обозначается как C 32 1 22.
Затем перенесите по 30 мл безводного диэтилового эфира в каждую из пяти пробирок Falcon объемом 50 мл. После добавления C 32 1 22 в безводный диэтиловый эфир образуется белый мутный раствор; перемешайте содержимое пробирки на вортексе, а затем центрифугируйте ее. Экстрагированный полимер соберется на дне пробирки; удалите верхний слой раствора и повторите эти действия еще два раза.
После извлечения поместите открытые пробирки в эксикатор и подвергните вакуумированию в течение ночи, убедившись, что пробирки защищены от света. На следующий день взвесьте пробирки, содержащие C 32 1 22, для определения конечной массы. В завершение растворите экстрагированный полимер в безводном DMSO до концентрации 100 mg/mL.
Для подготовки наночастиц сначала разведите плазмидную ДНК до конечной концентрации 120 µg/mL в ацетате натрия; во второй пробирке разведите C 32 1 22 до конечной концентрации 3,6 mg/mL в ацетате натрия. Объедините содержимое обеих пробирок в одной пробирке Falcon объемом 15 mL и немедленно перемешайте на вортексе на высокой скорости в течение 10 секунд.
Оставьте пробирку при комнатной температуре на 10 минут для формирования наночастиц. Замените среду в предварительно подготовленном флаконе для культивирования тканей на 7,8 milliliters полной среды DMEM.
Перенесите раствор наночастиц в флакон для культивирования тканей и равномерно распределите его перед помещением в инкубатор. Через два часа замените среду, содержащую наночастицы, на DMEM. Через четыре часа клетки будут готовы к инъекции in vivo.
Когда трансфицированные клетки будут готовы, подсчитайте их и разведите до плотности 10 × 10⁶ клеток на миллилитр в PBS, чтобы обеспечить получение каждой мышью равного количества клеток. Разделите клеточные суспензии по епробиркам объемом 110 µL. Затем проведите анестезию мыши, у которой ранее была вызвана ишемия задних конечностей.
После подтверждения анестезии путем щипка за палец очистите место инъекции с помощью шприца с иглой 27G. Ресуспендируйте клетки и наберите 100 µl суспензии. Введите половину клеточной суспензии в область приводящей мышцы, а затем введите вторую половину в область икроножной мышцы.
После инъекции оставьте шприц на месте минимум на 15–30 секунд, чтобы предотвратить утечку препарата. После завершения всех инъекций поддерживайте тепло животного до его полного восстановления. Для проведения биолюминесцентной визуализации подтвердите состояние анестезии путем щипка за пальчик лапы, после чего очистите место инъекции, как показано ранее.
Наберите в инсулиновый шприц 100 µL Люцифера и введите его внутрибрюшинно. Перед помещением животного в камеру для визуализации люциферазы ivus проведите съемку мышей с временем экспозиции одну минуту. После получения изображения отметьте область интереса.
В данном случае в месте инъекции клеток в ишемизированную конечность продолжают измерять сигнал люциферазы каждые три-пять минут до тех пор, пока сигнал не достигнет пика и не начнет снижаться. Это значение используется для сравнения между мышами и в разные моменты времени; по завершении процедуры мышей извлекают из камеры и содержат в тепле до полного восстановления. Ткани забирают в выбранные временные точки.
По прошествии времени после трансфекции и проведения эвтаназии сделайте циркулярный разрез кожи вокруг задней конечности в дистальной области живота и проксимальнее конечности. Откинув кожу, ампутируйте конечность между тазобедренным и бедренным суставами. В завершение изолируйте медиальную приводящую и икроножную мышцы.
Для дальнейшего анализа на этих изображениях представлена схема синтеза C 32 1 22. Здесь ACR-связанный терминальный C 32 AC был получен в результате реакции мик-присоединения между мономером с концевыми группами DAL и мономером с первичной аминной концевой группой. В данном примере модифицированные полимеры PBAE могут быть получены путем добавления мономеров с аминным терминалом для повышения эффективности трансфекции.
Успешная трансфекция подтверждается гиперэкспрессией зеленого флуоресцентного белка, как показано здесь. Данные биолюминесцентной визуализации демонстрируют состояние мыши в день 0 и на 14-й день. После инъекции GFP-люцифераз-положительных стволовых клеток, полученных из жировой ткани, в заднюю конечность, репрезентативные допплеровские изображения демонстрируют индукцию ишемии в одной из зеркальных задних конечностей в день 0 и последующую успешную реперфузию крови.
Через 14 дней после инъекции жировых стволовых клеток с гиперэкспрессией VEGF. С помощью R-T-P-C-R было подтверждено успешное повышение экспрессии vgf, кодирующего терапевтический белок, в опытной группе через четыре дня после введения клеток, в то время как в контрольной группе (PBS) экспрессия не была обнаружена. Для поиска новых терапевтических мишеней, способствующих регенерации тканей, могут быть применены и другие методы, сочетающие доставку стволовых клеток и генов.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как синтезировать биоразлагаемые полимеры для невирусной генной терапии и использовать эти полимеры для программирования стволовых клеток для лечения ишемии in vivo. Использование невирусных модифицированных стволовых клеток для сверхэкспрессии терапевтических факторов in situ может быть широко применимо при лечении целого ряда дегенеративных заболеваний.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании демонстрируется использование биоразлагаемых полимерных наночастиц для программирования стволовых клеток с целью гиперэкспрессии терапевтических факторов, стимулирующих ангиогенез. Метод валидирован с использованием мышиной модели ишемии задней конечности.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Терапия стволовыми клетками
- Ангиогенез
- Биоразлагаемые наночастицы
Теоретические сведения
- Терапевтическая гиперэкспрессия генов может усилить регенерацию тканей.
- Полимерные наночастицы служат эффективными средствами доставки генов.
- Стволовые клетки, полученные из жировой ткани, являются перспективным источником для регенеративной медицины.
- Модели ишемии задних конечностей обычно используются для изучения ангиогенеза.
Цель исследования
- Программирование стволовых клеток для сверхэкспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).
- Оценка эффективности данных программированных стволовых клеток в стимулировании ангиогенеза.
- Оценка потенциала биоразлагаемых наночастиц для доставки генов.
Используемые методы
- Синтез биоразлагаемых полимеров посредством двухэтапной реакции.
- Изготовление полимерных наночастиц, кодирующих терапевтические гены.
- Трансфекция стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека, in vitro.
- Инъекция запрограммированных стволовых клеток в ишемизированные задние конечности для оценки эффективности.
Основные результаты
- Успешная трансфекция стволовых клеток, приведшая к гиперэкспрессии VEGF.
- Наблюдаемое улучшение реперфузии крови в ишемизированной конечности.
- Количественный анализ экспрессии генов подтвердил локализованную экспрессию терапевтических факторов.
- Гистологическая оценка продемонстрировала регенерацию тканей.
Выводы
- Биоразлагаемые полимерные наночастицы эффективно доставляют терапевтические гены в стволовые клетки.
- Программированные стволовые клетки могут значительно усиливать ангиогенез в условиях ишемии.
- Данный метод является перспективным для будущей регенеративной терапии.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Данный подход решает проблему направленной и продолжительной доставки ангиогенных факторов при восстановлении ишемизированных тканей, используя хоминг стволовых клеток и биоразлагаемые невирусные векторы для повышения терапевтической точности. Программируя аутологичные стволовые клетки на гиперэкспрессию VEGF in situ, этот метод повышает прогностическую достоверность в доклинических моделях ангиогенеза и способствует снижению рисков при реализации стратегий клеточной регенерации. Он представляет собой трансляционную платформу для лечения ишемических заболеваний, при которых контролируемый рост сосудов имеет решающее значение для регенерации тканей и заживления ран.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать ангиогенные пути, управляемые VEGF, посредством контролируемой сверхэкспрессии в стволовых клетках.
- Практическая ценность: использование стволовых клеток, полученных из жировой ткани, в качестве масштабируемого аутологичного средства доставки терапевтических генов.
- Научная ценность: способствует снижению механистических рисков путем установления связи между экспрессией генов и функциональными результатами реперфузии in vivo.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Предлагает стандартизированную систему оценки эффективности невирусной доставки генов в стволовые клетки посредством гиперэкспрессии VEGF.
- Практическая ценность: Обеспечивает количественную оценку экспрессии трансгена и ангиогенного ответа с помощью биолюминесценции и допплеровской визуализации.
- Научная ценность: Обеспечивает воспроизводимость анализа за счет стандартизированного состава наночастиц и протоколов трансфекции стволовых клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Демонстрирует терапевтический ангиогенез на модели ишемии задней конечности мыши, подтверждая эффективность системы в условиях, релевантных заболеванию.
- Практическая ценность: Облегчает лонгитюдный мониторинг выживаемости клеток и реперфузии крови, что позволяет проводить долгосрочную оценку эффективности.
- Научная ценность: Связывает локализованную экспрессию VEGF с конечными точками регенерации тканей, поддерживая согласованность с трансляционными биомаркерами.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в континуум исследований — от инженерии стволовых клеток до доклинической валидации, что позволяет проверять гипотезы в области ангиогенеза и внедрять масштабируемые рабочие процессы клеточной терапии.
- Биология открытий: обеспечивает исследование пути VEGF и валидацию мишеней посредством индуцибельной гиперэкспрессии в стволовых клетках.
- Скрининг: позволяет проводить стандартизированную оценку эффективности доставки генов и ангиогенного потенциала in vitro и in vivo.
- Аналитика: обеспечивает получение количественных данных по экспрессии генов, биолюминесценции и перфузии для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: демонстрируют преемственность от программирования стволовых клеток до функционального ангиогенеза в ишемизированной ткани.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу невирусных векторов для программирования стволовых клеток по нескольким терапевтическим генным мишеням.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации ангиогенных мишеней за счет контролируемой локальной экспрессии факторов.
- Операционная ценность: Предлагает биоразлагаемую невирусную систему доставки с более низкой цитотоксичностью и высокой емкостью загрузки ДНК.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки («go/no-go»), снижая механистическую неопределенность в процессах ангиогенеза, опосредованного стволовыми клетками.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию VEGF и других ангиогенных мишеней в программах по лечению ишемических заболеваний с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области химии полимеров, разработки рецептур наночастиц, а также культивирования и трансфекции стволовых клеток.
- Необходим доступ к оборудованию для работы в инертной атмосфере при синтезе полимеров и к стерильным условиям для культивирования клеток при трансфекции.
- Требуется стандартизация размера, заряда и степени загрузки ДНК наночастиц в разных партиях для обеспечения воспроизводимости трансфекции.
- Необходима адаптация протоколов дозирования и инъекций при переходе к различным источникам стволовых клеток или моделям ишемии.
- Возможности ограничены необходимостью в инфраструктуре для визуализации in vivo с целью лонгитюдного отслеживания выживаемости клеток и терапевтической эффективности.
