Стволовые Программирование Клетки для терапевтической ангиогенеза Использование биоразлагаемых полимерных наночастиц

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать использование полимерных наночастиц для сверхэкспрессии терапевтических генов в стволовых клетках с использованием модели ишемии морских задних конечностей. Это достигается путем синтеза биоразлагаемых полимеров с помощью двухступенчатой реакции mic edition, а затем изготовления полимерных наночастиц, кодирующих терапевтические гены. Вторым шагом является трансфекция стволовых клеток жировой ткани человека in vitro в сверхэкспрессированный фактор роста эндотелия сосудов.

Затем запрограммированные стволовые клетки вводятся внутримышечно в ишемизированную заднюю конечность для производства НК двух терапевтических факторов. Заключительным этапом является мониторинг выживаемости клеток и реперфузии крови в ишемизированной конечности с течением времени с помощью биолюминесцентной визуализации и лазерной допплерографии. В конечном счете, количественная экспрессия генов и гистология могут быть выполнены, чтобы показать локализованную экспрессию терапевтических факторов и эффективность регенерации тканей.

Преимущество этой методики перед традиционными методами ангиогенеза заключается в использовании стволовых клеток в качестве средств доставки лекарств. Эта стратегия позволяет нам использовать естественную способность стволовых клеток мигрировать в сторону ишемии, а также обеспечивает динамическую реакцию на сигналы микросреды. Наночастицы, используемые для доставки ДНК из плазмы, обладают высокой эффективностью и биодеградируемостью, что позволяет снизить цитотоксичность и увеличить количество внутриклеточных копий ДНК.

Этот метод может быть применен ко многим клинически значимым клеточной терапии, поскольку в нем используется биоразлагаемый невирусный вектор для вставки генов в аутологичные клетки. Далее в тот же флакон добавляем пять разогретых амино и пентола. Немедленно поместите флакон на пластину для перемешивания и установите скорость на 600 об/мин.

Перенесите флакон в духовку, установленную при температуре 90 градусов Цельсия, и увеличьте скорость перемешивания до 1000 об/мин через четыре часа, уменьшите скорость до 300 об/мин и перемешивайте еще 12-16 часов. Когда все будет готово, добавьте 10 миллилитров безводного тетра гидроурана к пяти граммам C 32 в стеклянный флакон, содержащий мешалку. После завернуть в фольгу вихрь на высокой мощности до полного растворения в отдельном стеклянном флаконе, содержащем мешалку, добавить 10 миллимоляров тетраэтиленгликоля диамина.

Добавьте в этот флакон 40 миллилитров ТГФ, поместите оба флакона на тарелку для перемешивания на пять минут, прежде чем соединить их вместе. Накройте полученное вещество пленкой и оставьте для поддержания комнатной температуры на 24 часа. Конечный продукт обозначается как C 32 1 22.

Далее переложите по 30 миллилитров безводного датилового эфира в каждую из пяти 50-миллилитровых соколиных пробирок. После добавления С 32 1 22 к безводному диловому эфиру белый мутный раствор образует вихревой контур пробирки и затем центрифугирует ее. Извлеченный полимер соберется у основания трубки, выбросит верхний раствор и повторит эти действия еще два раза.

После извлечения поместите открытые пробирки в влагопоглотитель и пропылесосьте на ночь, убедившись, что пробирки защищены от света. На следующий день взвесьте трубки, содержащие C 32 1 22, чтобы определить окончательную массу. Наконец, растворите экстрагированный полимер в безводном ДМСО в концентрации 100 мг на миллилитр.

Для приготовления наночастиц. Во-первых, разбавляют плазменную ДНК до конечной концентрации 120 мкг/миллилитр в ацетате натрия, во второй пробирке разбавляют C 32:122 до конечной концентрации 3,6 мкг/миллилитр. В ацетате натрия смешайте содержимое каждой пробирки в одну 15-миллилитровую пробирку Falcon и немедленно включите вихрь на высокой мощности в течение 10 секунд.

Дайте трубке постоять при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы произошло образование наночастиц во время формирования наночастиц. Замените среду в предварительно установленной колбе для культуры тканей на 7,8 миллилитров. Полностью дополнен DMEM.

Переложите раствор наночастиц в колбу для культуры тканей и равномерно распределите его перед помещением в инкубатор. Через два часа замените среду, содержащую наночастицы, на DMEM. Через четыре часа клетки готовы к инъекции in vivo.

Когда трансфицированные клетки будут готовы, подсчитайте клетки с плотностью 10 умножить на 10 из шести клеток на миллилитр в PBS, чтобы гарантировать, что каждая мышь получит равное количество. Разделите клеточные суспензии в пробирки эйнора объемом 110 микролитров. Далее проведите обезболивание мыши, которая ранее подверглась ишемии задних конечностей.

После подтверждения анестезии путем защемления пальца ноги очистите место инъекции шприцем 27 калибра. Повторно суспензируйте клетки и наберите 100 микролитров суспензии. Введите половину клеточной суспензии в область приводящей мышцы, а затем введите другую половину в область икроножной мышцы.

После инъекции оставьте шприц на месте не менее чем на 15–30 секунд, чтобы предотвратить утечку. Когда инъекции будут завершены, держите животное в тепле до полного выздоровления. Для биолюминесцентной визуализации подтвердите анестезию щипцом пальца ноги, а затем очистите место инъекции, как показано ранее.

Наполните инсулиновый шприц 100 микролитрами Люцифера и введите его внутрибрюшинно. Перед тем, как поместить животное в камеру визуализации ivus Luciferase, сделайте снимки мышей с временем экспозиции в одну минуту. Когда изображение будет получено, отметьте интересующую область.

В этом случае ишемизированная конечность в месте инъекции клетки продолжает измерять сигнал люциферазы каждые три-пять минут до тех пор, пока сигнал не достигнет пика и не начнет снижаться. Это значение используется для сравнения между мышами и по промежуткам времени, когда они будут завершены, уберите мышей из камеры и держите животное в тепле до полного выздоровления. Ткани собирают в определенное время.

Точки после трансфекции после эвтаназии разрежьте кожу вокруг задней конечности по окружности в дистальном отделе живота и проксимальнее задней конечности. После оттягивания кожи ампутируйте конечность между тазовым и бедренным суставами. Наконец, медиальная приводящая мышца и икроножная мышца изолируются.

Для дальнейшего анализа эти изображения показывают синтез C 32 1 22. В данном случае, связанный с ACR терминированный C 32 AC был образован реакцией микрофонного издания между мономером с концевыми группами DAL и мономером с первичной и средней конечной группой. В этом примере модифицированные полимеры PBAE могут быть получены путем добавления мономеров со средним окончанием для повышения эффективности трансфекции.

Успешная трансфекция проявляется в сверхэкспрессии зеленого флуоресцентного белка, как показано здесь. Эти данные биолюминесцентной визуализации показывают мышь на нулевой и 14-й день. После введения GFP люцифераз-положительных жировых стволовых клеток в заднюю конечность, репрезентативные допплеровские изображения демонстрируют индукцию ишемии на одной стороне зеркальной задней конечности в нулевой день и успешную реперфузию крови.

Через 14 дней после инъекции VEGF сверх экспрессирующих жировых стволовых клеток. R-T-P-C-R подтвердил успешную апрегуляцию vgf, кодируемого терапевтического белка в группе лечения через четыре дня после инъекции клеток, в то время как в контроле PBS экспрессия не была обнаружена. Другие методы, в которых применяется комбинированный подход к доставке стволовых клеток и генов, могут быть выполнены для выявления новых терапевтических мишеней для стимулирования регенерации тканей.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как синтезировать биоразлагаемые полимеры для невирусной генной терапии и использовать эти полимеры для программирования стволовых клеток для лечения ишемии и жизни.