Протоколы для Реализация Кишечная палочка На основании TX-TL Cell-СВОБОДА СЛОВА Система синтетической биологии
16 сентября 2013 г.
Этот пятидневный протокол описывает все шаги, оборудование и дополнительное программное обеспечение, необходимое для создания и запуска эффективной эндогенного Escherichia TX-TL бесклеточный системы выражение с нуля палочка основе. С реагентов, протокол занимает 8 часов или меньше в настройки реакции, сбора и обработки данных.
Общей целью этой процедуры является создание системы бесклеточной экспрессии на основе ecoli, называемой транскрипционной трансляцией или TX tl. Это достигается путем предварительного изготовления трех исходных компонентов для экстракта сырых клеток TX TL, раствора аминокислоты и энергетического раствора. Раствор аминокислоты и энергетический раствор позже будут объединены для создания буфера TX TL.
Вторым шагом является калибровка экстракта сырых клеток для определения оптимальных концентраций магния, калия и DTT для получения реакций TX TL с максимальными уровнями экспрессии. Затем результаты калибровки используются для создания трехтрубочной системы TX TL, состоящей из буферного экстракта сырых клеток и ДНК. Заключительным этапом является проведение реакции TX TL с использованием только что изготовленных реагентов.
В конечном счете, TX TL используется для демонстрации схем синтетической биологии, а также традиционных приложений бесклеточной экспрессии. Этот метод может помочь в тестировании схем в области синтетической биологии, обеспечивая равную среду in vitro, которая имитирует среду in vivo. Последствия этого метода распространяются на увеличение скорости синтетического биологического дизайна за счет устранения необходимости проводить все этапы прототипирования in vivo.
Ассистировать процедуре будет Клэр Хейс, научный сотрудник нашей группы. Обратите внимание, что в этом видео будут проходить только избранные участки протокола, критически важные для съемки. Полный текст протокола доступен в текстовой статье.
Ранее в этом протоколе выращивались и гранулировались бактериальные клетки. Теперь бактериальные клетки будут лизироваться с помощью бисера. Держите на льду все 50-миллилитровые соколиные пробирки, содержащие клеточную суспензию.
Для целей этого видео будет продемонстрировано бисероплетение только для одной трубки. Бусины должны быть добавлены в трубку Falcon по три аликвоты каждая, используя одну треть от общего количества бусин. Добавьте первую аликвоту бусин в трубку вихря на 30 секунд и выложите на лед.
Таким же образом добавляем вторую аликвоту из бусин, вихрь и выкладываем на лед. После добавления последней аликвоты и вортексирования убедитесь, что бусины равномерно распределены, после третьего этапа вортексинга должна образоваться густая паста. Поставьте трубку на лед.
Приготовьте кончик пипетки объемом пять миллилитров, отрезав его конец стерильными ножницами. Чтобы создать отверстие в три-четыре миллиметра, наберите дозатор до двух миллилитров. Положите на лед 20 стерильных трубочек для бусин.
Используйте модифицированную пипетку, чтобы проверить высокую вязкость раствора шариковых ячеек. Он должен быть вязким до такой степени, чтобы едва выходить из наконечника пипетки. Во время выброса удалите раствор шариковых ячеек из трубки Falcon и переложите в трубку для шариков.
Заполняя его на три четверти полным вращением, крайне быстро в мини-центрифуге. Чтобы удалить пузырьки воздуха без перераспределения шариков, закончите добавление раствора шариковых ячеек в трубку, чтобы сформировать вогнутый мениск. Затем добавьте очень маленькую каплю раствора шариковых ячеек на внутреннюю часть крышки трубки для шариков.
Будьте осторожны, чтобы не налить раствор на внешнюю кромку колпачка. В противном случае трубка для бусин не будет закрываться достаточно. Постучите колпачком по ровной поверхности и убедитесь, что на нижней части колпачка нет пузырьков воздуха.
Закупорьте бусину на трубочку для взбивания. Если все сделано правильно, крышка должна быть плотно закрыта. Пузырьки воздуха не должны быть видны, и с этого момента раствор ячейки для шариков должен переливаться, требуется два человека, чтобы эффективно выполнить бисероплетение.
Передайте заполненную трубку помощнику для бисероплетения, в то время как первый демонстратор продолжает заполнять еще несколько трубок для бисерных бусин оставшимся раствором бисерных ячеек. Возьмите наполненную бусину трубку и положите ее на лед. После того как две заполненные трубки для бусин были собраны и находились на льду не менее минуты.
Начните шборт одной трубкой в течение 30 секунд при 46 об/мин. Положите вниз головой на лед на 30 секунд, одновременно взбивая другую трубку. Повторите нанесение бусин и глазурь таким образом, чтобы каждая заполненная трубка для бусин взбивалась в общей сложности в течение одной минуты.
После того, как все заполненные трубки для бусин будут обработаны, соорудите фильтрующий аппарат из 15-миллилитровой трубки для сокола. Во-первых, добавьте новый колпачок для бусин плоской стороной вверх до дна трубки. Затем снимите колпачок с трубки для бусин и плотно прижмите колонку микрохроматографии к концу трубки для бусин до полного запечатывания.
Отломите элуцианский конец микрохроматографической колонки и поместите его на элуциан. Закончите вниз пустой трубкой для бусин. Поместите этот комплекс в 15-миллилитровую соколиную трубку.
Сконструируйте фильтрующие аппараты для всех наполненных трубок для взбивания шариков и держите их на льду. После завершения центрифугирования, фильтр аппарата Falcon Tube раскрывается при температуре 6 000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы отделить экстракт и гранулы от гранул. После центрифугирования убедитесь, что в каждой трубке для бусин получен жизнеспособный экстракт.
Правильно взбитый экстракт не будет мутным, а гранула будет иметь два отдельных слоя, как показано на трубке слева. Мутные трубки, как показано на примере справа, должны быть утилизированы. Переложите надосадочную жидкость из нетуридных пробирок в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,75 миллилитров, взяв как можно меньше гранул.
Держите на льду, пока не будут обработаны все трубки для бисероплетения. Затем раскрутите пробирки микроцентрифуги вниз и соберите надосадочную жидкость. После консолидации 500 микролитров надосадочной жидкости без гранул в новую трубку для валиков.
Инкубируйте пробирки со снятыми крышками при 220 об/мин и 37 градусах Цельсия в течение 80 минут. Это позволит переварить оставшиеся нуклеиновые кислоты с помощью эндогенной экзонуклеазы, высвобождаемой в процессе бисероплетения. Когда инкубация будет завершена, экстракт должен выглядеть мутным.
Консолидируйте экстракт в микроцентрифужных пробирках объемом 1,75 миллилитров до 1,5 миллилитров на пробирку центрифуги при 12 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. С помощью пипетки консолидируйте надосадочную жидкость без гранул либо в микроцентрифужную пробирку объемом 1,75 миллилитров для меньшего выхода, либо в пробирку сокола объемом 15 миллилитров для большего выхода на льду. Закройте тюбик крышкой и хорошо перемешайте, перевернув.
Оставьте 10 микролитров надосадочной жидкости на льду для последующего измерения концентрации белка. Определите общее количество полученного экстракта и гидратируйте необходимое количество 10 молекулярных отсечных диализных кассет путем погружения в буфер S 30 B на две минуты. Загрузите в кассеты до 2,5 миллилитров экстракта.
В каждый стакан можно вместить до двух кассет диализного помешивания при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех часов. Обратитесь к написанной статье для получения информации об этапах обработки после диализа. Базовая реакция трансляции транскрипции состоит из трех частей: сырого клеточного экстракта, буфера и ДНК.
Хотя реакции могут различаться по объему, в этом протоколе используется заранее написанный шаблон для проведения реакции объемом 10 микролитров. Здесь. Пункты, выделенные фиолетовым цветом, обозначают значения, вводимые пользователем, а элементы, выделенные синим цветом, указывают на дополнительные реагенты, которые необходимо добавить в конструкцию эксперимента в силисе с использованием секции подготовки мастер-смеси и секции подготовки ДНК. Как правило, константы могут быть помещены в секцию подготовки мастер-микса, в то время как переменные могут быть помещены в секцию подготовки ДНК.
Сведите к минимуму количество образцов в эксперименте, чтобы избежать испарения образца и смещения времени начала эксперимента. Пример настройки приведен в этой таблице. Чтобы подготовить образцы ДНК для каждого образца, ID выложите указанную воду для ДНК и предоставленные пользователем предметы в микроцентрифужную пробирку.
При комнатной температуре приготовьте основную смесь, состоящую из буферного экстракта и любых предметов, предоставленных пользователем по всему миру, которые держатся на льду и закручиваются. После добавления каждого элемента добавьте соответствующее количество мастер-микса к каждому образцу ДНК и держите при комнатной температуре. Рассматривайте это как время начала реакции.
Окуните каждый образец и центрифугируйте при давлении 10 000 G в течение 30 секунд при комнатной температуре, чтобы удалить остаточный образец и уменьшить количество пузырьков. Запустите реакцию в 384-луночной пластине при температуре 29 градусов Цельсия. Время выполнения зависит от эксперимента, но обычно составляет менее восьми часов.
По завершении прогона данные могут быть считаны с помощью считывателя пластин. В данной статье представлен пятидневный протокол подготовки эндогенной транскрипционной трансляции на основе кишечной палочки или системы бесклеточной экспрессии TXTL. Условия экспрессии этой системы были оптимизированы путем тестирования эффектов различных методов обработки плазмид и элуцианского буфера.
Некоторые переменные, вводимые в систему TXTL, должны быть предварительно откалиброваны на токсичность, например, при сравнении методов обработки плазмид в одном методе очистки используется только мини-набор для подготовки кайи, в то время как во втором методе очистки плазмида готовится с использованием того же мини-набора для подготовки, а затем подвергается последующей обработке с помощью каяка. Набор для быстрой очистки ПЦР. Этот график показывает конечную флуоресценцию через восемь часов, а также максимальную скорость производства белка на основе 12-минутного скользящего среднего
значения.Наблюдаемая разница в выражении обусловлена разницей в содержании солей. Однако другие элементы могут не оказывать никакого влияния на TXTL, такие как элюцианский буфер. Различные концентрации хлорида TS сравнивали в реакции бесклеточной экспрессии, основанной на экспрессии одного аномоляра плазмиды.
Приведенные концентрации являются конечными концентрациями трис хлорида. В реакции используется элюцианский буфер с погрешностью 10 миллимоляров трис хлорида, погрешность стержней составляет одно стандартное отклонение от трех независимых прогонов в разные дни. На этом рисунке показаны типичные графики калибровки для экстракта сырых клеток, откалиброванные на дополнительные уровни глутамата магния, глутамата калия и DTT.
Показана конечная флуоресценция через восемь часов, а также максимальная скорость производства белка на основе 12-минутной скользящей средней. Обратите внимание, что каждый экстракт сырых клеток должен быть откалиброван независимо по этим трем переменным. В целом, результаты показывают, что экстракт сырых клеток наиболее чувствителен к уровню глутамата магния, за которым следует уровень глутамата калия.
Исходя из этих графиков, приемлемый диапазон дополнительного глутамата магния составляет четыре миллимоля, глутамат калия составляет от 60 до 80 миллимоляров, а DTT составляет от нуля до трех миллимоляров с нижней стороны. Конечная эффективность каждого препарата из сырого клеточного экстракта может варьироваться в зависимости от квалификации пользователя и условий окружающей среды. Несмотря на то, что типичное изменение выхода составляет от 5 до 10%, здесь показана конечная флуоресценция двух сырых экстрактов, приготовленных в разные даты.
Погрешности — это одно стандартное отклонение от трех независимых прогонов в разные дни. Чтобы продемонстрировать бесклеточную систему экспрессии, была построена и протестирована петля отрицательной обратной связи, основанная на подавлении Tet. Один и тот же цикл с ТС и без него показал семикратную конечную экспрессию. Смена репортера D-E-G-F-P после восьми часов погрешностей выражения представляет собой одно стандартное отклонение от трех независимых прогонов в разные дни.
Генетическая цепь показана на врезке. На этом последнем рисунке показан анализ стоимости и экспрессии конкурирующих экстрактов сырых клеток. Круговая диаграмма в виде круговой диаграммы разбивает затраты на рабочую силу и материалы системы бесклеточной экспрессии TX TL на основе стоимости реагентов по состоянию на декабрь 2012 года и затрат на рабочую силу в размере 14 в час.
На панели B сравниваются затраты на систему бесклеточной экспрессии TX с другими коммерческими системами. Затраты разбиты на микролитр, хотя объемы реакции могут варьироваться в зависимости от комплекта. Затраты на материалы для этой системы составляют около 3 центов за микролитр реакции, что на 98% меньше по сравнению с аналогичными коммерческими бесклеточными системами.
На панели C показано сравнение выхода системы бесклеточной экспрессии TX TL с другими коммерческими системами. Эта система может производить до 0,75 мг на миллилитр репортерного белка, используя либо промотор на основе Sigma 70 с операторами фагов Lambda, либо промотор с управлением T 7. Эти сравнения показывают, что система бесклеточной экспрессии TX TL может производить эквивалентное количество белка, как системы на основе T seven, что значительно снижает стоимость аналогичных коммерческих систем.
Мы надеемся, что этот метод проложит путь к упрощению инженерного процесса в синтетической биологии.
Обзор
В данном протоколе подробно описаны создание и эксплуатация бесклеточной системы экспрессии на основе Escherichia coli, известной как TX-TL. Процесс включает подготовку основных компонентов, калибровку экстрактов и проведение реакций TX-TL для применения в области синтетической биологии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Синтетическая биология
- Бесклеточные системы
- Транскрипция и трансляция
Теоретические сведения
- Системы TX-TL позволяют осуществлять синтез белков in vitro.
- Этот метод упрощает тестирование синтетических биологических цепей.
- Бесклеточные системы устраняют необходимость в прототипировании in vivo.
- Обеспечивают эффективное получение белков для исследований и практического применения.
Цель исследования
- Создание надежной бесклеточной системы экспрессии TX-TL.
- Оптимизация условий для обеспечения максимального уровня экспрессии белка.
- Демонстрация применимости системы TX-TL в синтетической биологии.
Используемые методы
- Приготовление неочищенного клеточного экстракта, растворов аминокислот и источников энергии.
- Калибровка экстракта для определения оптимальных условий реакции.
- Проведение реакций TX-TL с использованием подготовленных компонентов.
- Использование метода дробления стеклянными шариками для лизиса клеток и приготовления экстракта.
Основные результаты
- Успешное получение жизнеспособных экстрактов TX-TL.
- Установление оптимальных условий для синтеза белка.
- Демонстрация эффективности системы в синтетической биологии.
- Создание воспроизводимого протокола для дальнейших исследований.
Выводы
- Система TX-TL является мощным инструментом для исследований в области синтетической биологии.
- Оптимизированные протоколы повышают скорость биологического проектирования.
- Данный метод предоставляет универсальную платформу для экспрессии белков.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол позволяет осуществлять быстрое прототипирование генетических цепей и экспрессию белков в контролируемой среде in vitro, снижая зависимость от трудоемких рабочих процессов in vivo. Сохраняя эндогенные механизмы транскрипции и трансляции E. coli, система предоставляет физиологически релевантную платформу для минимизации рисков при проектировании в области синтетической биологии. Снижение затрат на 98% по сравнению с коммерческими альтернативами обеспечивает возможность масштабируемого и итеративного тестирования на ранних этапах поиска, повышая эффективность использования капитала и ускоряя циклы «проектирование-сборка-тестирование».
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять гипотезы о работе генетических цепей и регуляторных элементов в эндогенных условиях E. coli, что проясняет поведение путей и функцию мишеней.
- Практическая ценность: обеспечивает итеративное проектирование конструктов синтетической биологии без ограничений по росту клеток, сокращая сроки проведения экспериментов по валидации мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные показатели экспрессии белка на основе ДНК-матриц, что делает возможным анализ зависимости «доза-ответ» и кинетический анализ работы генетических цепей.
- Практическая ценность: Стандартизированный трехпробирочный формат TX-TL обеспечивает воспроизводимость между сериями экспериментов, что способствует стандартизации анализа для проведения скрининговых кампаний.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Позволяет исследовать биологические явления и осуществлять крупномасштабную сборку цепей в системе, которая отражает эндогенную клеточную динамику, что повышает трансляционную значимость.
- Практическая ценность: Позволяет получить достаточное количество экстракта для проведения до 3 000 реакций из одной пятидневной подготовки, что обеспечивает возможность высокопроизводительного доклинического прототипирования.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум процесса поиска лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, предоставляя бесклеточную платформу для оценки функциональности генетических цепей перед переходом к клеточным или моделям in vivo.
- Открывающая биология: Тестирование транскрипционной и трансляционной регуляции синтетических цепей для механистического анализа и снижения рисков при проверке гипотез о мишенях.
- Скрининг: Получение количественных показателей флуоресценции или люминесценции в стандартизированных условиях, что позволяет проводить сравнительную оценку вариантов цепей.
- Аналитика: Предоставление показателей конечной флуоресценции и максимальной скорости продукции белка, что позволяет командам оценивать эффективность экспрессии и оптимизировать условия.
- Трансляционные исследования: Обеспечение преемственности с эндогенной биологией E. coli, что способствует экстраполяции на клеточные системы для доклинической валидации.
- Корпоративное повторное использование: Централизованная подготовка экстракта создает ресурс многократного использования, что снижает стоимость одного эксперимента и обеспечивает стандартизацию между различными проектами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования за счет сохранения естественных скоростей деградации мРНК и ДНК, что снижает механистическую неопределенность в поведении контура.
- Операционная ценность: устраняет необходимость в этапах клонирования и культивирования клеток, упрощая рабочий процесс и ускоряя получение данных.
- Стратегическая ценность: позволяет быстрее принимать решения о целесообразности работы с объектами синтетической биологии за счет быстрого прототипирования конструкций в экономически эффективной системе.
- Влияние на портфель проектов: способствует приоритезации с учетом рисков благодаря недорогому и высоковоспроизводимому тестированию множества итераций дизайна.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области молекулярной биологии и методов экспрессии белков для приготовления и калибровки экстракта.
- Необходим доступ к гомогенизатору с шариками, центрифуге и планшетному ридеру для лизиса, осветления и мониторинга реакции.
- Требуется стандартизация концентраций магния, калия и DTT в разных партиях для обеспечения стабильной работы экстракта.
- При планировании масштабов реакции необходимо учитывать вариабельность выхода сырого клеточного экстракта от партии к партии, которая обычно составляет 5–10%.
- Ограничение восьмичасового окна реакции может потребовать оптимизации для конструктов с низкой скоростью экспрессии или цепей с циркадной регуляцией.
