Видеоморфометрический анализ гипоксической легочной сосудоборства внутриположных артерий с использованием Murine Precision Cut Lung Slices

Общая цель данной процедуры заключается в анализе гипоксической легочной вазоконстрикции зеркально расположенных внутрилегочных артерий с внутренним диаметром от 20 до 100 микрон. Это достигается путем первоначального заполнения дыхательных путей легких низкоплавким воском. На втором этапе с помощью вибратома изолированные легкие разрезают на срезы толщиной 200 микрон.

Затем арос извлекают из срезов легкого путем инкубации при 37 °C в теплой среде, насыщенной нормоксическим газом, что обеспечивает медленное перемещение срезов в жидкости. После этого отдельный срез легкого переносят в проточную камеру для суперфузии, после чего проводят видеоморфометрический анализ вазореактивности поперечного сечения артерии.

В конечном итоге оцениваются изменения площади просвета сосуда в ответ на различные воздействия. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как intravital-микроскопия субплевральных микрососудов или измерение сосудистого тонуса в изолированных проксимальных легочных артериях, является возможность количественного анализа реактивности внутрилегочных артерий диаметром от 20 до 100 мкм. Процедуру продемонстрируют Анна Голденберг и два лаборанта этой лаборатории.

Сразу после умерщвления мыши путем вывиха шейных позвонков вскройте брюшную полость, отодвиньте петли кишечника в сторону и перережьте крупные сосуды брюшной полости для обескровливания. Затем с помощью тонких ножниц проколите диафрагму. Это приведет к коллапсу легких в результате попадания воздуха в плевральную полость.

Продолжайте разрезать, чтобы отделить диафрагму от нижнего отверстия грудной клетки. Теперь латерально перережьте ребра и ключицу. Чтобы удалить вентральную часть грудной клетки, извлеките тимус.

Наполните шприц теплым перфузионным буфером. Затем сделайте небольшое отверстие в левом желудочке сердца. Отрегулируйте поток перфузионного буфера и медленно проведите перфузию легочных сосудов через правый желудочек до тех пор, пока легкие не станут белыми.

Затем удалите слюнные железы, мелкие мышцы и соединительную ткань с трахеи. Отделите трахею от окружающей соединительной ткани и вставьте нить швейного хлопка между пищеводом и трахеей для последующего лигирования. Затем с помощью микроножниц сделайте небольшое отверстие в верхней части трахеи между двумя соседними трахеальными хрящами.

Заполнив шприц подогретым до 37 °C низкоплавким агарозом, подсоедините его к гибкой пластиковой канюле и медленно надавите на plunger, пока из канюли не выйдет весь воздух. Вставьте канюлю в небольшое отверстие в трахее и аккуратно зафиксируйте ее с помощью хлопковой нити. Затем медленно заполните дыхательные пути агарозом и осмотрите легкие.

Сначала начинает расправляться правое легкое, затем левое. Через 30–40 секунд заполнение завершается, и оба легких раздуваются до объема, сопоставимого с ситуацией in vivo, что составляет примерно 1,2–2,0 миллилитров. В зависимости от пола, возраста и веса, важно вводить раствор достаточно быстро, чтобы он не успел затвердеть в процессе процедуры, но не слишком быстро, чтобы не повредить легкие.

После одновременного заполнения легких извлеките пластиковую канюлю и перевяжите трахею хлопковой нитью, чтобы предотвратить вытекание агароза. Затем перережьте трахею выше лигатуры, и для того чтобы отделить легкие и сердце блоком от грудной клетки, перенесите органы в ледяной раствор Рингера с агарозой для затвердевания агароза, что происходит в течение нескольких минут ожидания. Используя суперклей, прикрепите кусочек пробки от шампанского к держателю образцов вибратома, чтобы он служил опорой для ткани легкого. После затвердевания агароза отделите отдельные доли легких.

Затем с помощью суперклея прикрепите одну долю к держателю для образцов. Чтобы получить поперечные срезы мелких внутридолевых артерий, возьмите краниальную долю правого легкого и приклейте ее поверхностью корня к держателю; затем, используя вибратом с новым лезвием, делайте срезы от периферии, нарезая долю легкого ломтиками толщиной 200 micron. Чтобы получить поперечные срезы более крупных преддолевых артерий, совместите корень левого легкого с пробкой от шампанского и приклейте долю к держателю в такой ориентации, после чего выполняйте срезы от периферии для удаления аорты.

Перенесите срезы органов в стеклянный стакан, наполненный примерно 200 миллилитрами MEM при температуре 37 °C. Поместите стакан в термостат и продувайте нормоксической газовой смесью, чтобы срезы легких медленно перемещались в среде. Примерно через два часа пузырьки воздуха, заполнявшие ткани, выйдут из легочной ткани, и срезы осядут на дно стакана.

Для видеоморфометрического анализа внутрилегочных артерий перенесите срез легкого в проточную суперфузионную камеру, установленную на микроскопе и заполненную 1,2 миллилитрами газоситерилизованной MEM с нормальным содержанием кислорода. Зафиксируйте срез легкого на дне камеры с помощью нейлоновых нитей, прикрепленных к платиновому кольцу. Начните перфузию камеры средой с нормальным содержанием кислорода.

Используйте фазово-контрастный микроскоп с объективом 10x для поиска в срезе легкого артерий в поперечном сечении с внутренним диаметром от 20 до 100 мкм. После обнаружения подходящего сосуда используйте объектив 20x для получения изображения пре-аснера сосуда или, как показано здесь, объектив 40x для получения изображения интра-аснера артерии с целью измерения внутреннего диаметра сосуда. Перед началом эксперимента настройте программное обеспечение для автоматической съемки поперечного сечения артерии каждую минуту на протяжении всего эксперимента.

После выполнения фотографирования продолжайте перфузию камеры нормоксической средой Gast в течение 10 минут. Затем погрузите срез легкого в раствор U 466 19 на 10 минут без протока для анализа сократимости артерии, используя только те сосуды, площадь просвета которых сократилась под действием U 466 19 не менее чем на 30%. Вымойте препарат нормоксической средой Gast в течение 10 минут.

Затем расширьте артерию путем применения res в течение 10 минут при отсутствии кровотока. Снова удалите препарат, промывая в течение 10 минут нормоксической газированной средой со скоростью потока 6 мл/мин, после чего в течение 10 минут поддерживайте поток 0,7 мл/мин. Затем инкубируйте срез легкого в высокогипоксической газированной среде в течение 40 минут.

Также подавайте гипоксическую газовую смесь в воздушное пространство перфузионной камеры через дополнительный набор трубок. Удалите гипоксическую среду, промыв камеру в течение 20 минут нормоксической газированной средой, и переключите поток газа в воздушном пространстве камеры с гипоксического на нормоксический, чтобы проверить жизнеспособность сосуда. В конце эксперимента введите U 466 19 в перфузионную камеру и инкубируйте в течение 20 минут без потока для индукции вазоконстрикции.

Повторите эти шаги с новым срезом легкого, чтобы измерить вазореактивность другого сосуда. Начните анализ с загрузки изображений поперечных срезов артерий в программу для анализа изображений. Затем с помощью курсора обведите площадь просвета сосуда.

Высушивание рук необходимо, чтобы избежать появления артефактов, например, из-за прикрепления клеток крови к сосудистой стенке. Продолжайте анализировать изображения поперечных срезов аналогичным образом. Следует анализировать каждое изображение при смене одного условия в проточной инкубационной камере на другое, однако при неизменности условий достаточно анализировать каждое второе изображение.

Гипоксическая легочная вазоконстрикция наблюдается на этих фазово-контрастных изображениях поперечного сечения пре-ASIN артерии, которая проходит в непосредственной близости от поперечного сечения бронха. Снимки сделаны в моменты времени, отмеченные кружками на графике: в начале измерения, в конце измерения с U 466 19, в конце воздействия RAs, через 30 или 40 минут в среде с гипоксическим газом, после промывки средой с нормоксическим газом и после финального применения U 466 19. Вазореактивность регистрируется как относительные изменения площади просвета артерии в поперечном сечении в зависимости от времени. Площадь в начале эксперимента принимается за 100%, а вазоконстрикция выражается значениями относительно начальной площади.

В данном случае воздействие гипоксии вызывает сокращение площади просвета на 60% для более четкой демонстрации гипоксического ответа. Начальная фаза эксперимента, в которой тестировалась сосудистая реактивность, здесь не показана, а значение, полученное непосредственно перед воздействием пониженного содержания кислорода, принимается за 100%. Другим типом сосудов, исследуемых в данной работе, являются внутриакцинарные артерии, расположенные в местах прикрепления альвеолярных перегородок. В этой серии экспериментов с данной целью анализируется влияние сидала, неселективного открывателя митохондриальных АТФ-зависимых калиевых каналов, на гипоксическую легочную вазоконстрикцию малых внутриакцинарных артерий.

Срезы инкубируют в гипоксической среде. В отсутствие или присутствии 50 мкМ сидала проводят контрольные инкубации в нормоксической среде гаст для более четкого представления ответа на нормоксию, гипоксию или гипоксию с добавлением сидала. Значения, полученные непосредственно перед воздействием нормоксической или гипоксической среды гаст, принимаются за 100%. Артерия, подвергнутая воздействию пинеала, не демонстрирует уменьшения площади, как и артерия, инкубированная в гипоксической среде без добавок.

В среде с нормальным содержанием кислорода изменений площади просвета не обнаружено. Записи показателей малых внутри-ASIN артерий, подвергнутых воздействию гипоксической среды с добавлением 50 micromolar сидала или без него, представлены в виде среднего значения плюс или минус SEM. На данном графике представлены относительные данные по отношению к значению в начале гипоксической инкубации.

Вазореактивность не обнаруживается. В срезах легких, подвергнутых воздействию гипоксического газа, сокращение сосудов, индуцированное U 466 19 в среде, не подвергается влиянию препарата. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготовить прецизионный микротом, нарезать срезы легких и использовать их для количественного измерения вазореактивности малых интраальвеолярных артерий с диаметром от 20 до 40 мкм, расположенных в стенках альвеолярных перегородок, и более крупных преальвеолярных артерий с диаметром от 40 до 100 мкм, которые проходят вдоль бронхов и бронхиол.