Видеоморфометрический анализ гипоксической легочной сосудоборства внутриположных артерий с использованием Murine Precision Cut Lung Slices

Гипоксическая легочная сосудоконтрика (ВПЧ) является важным физиологическим явлением, при котором при альвеолярной гипоксии перфузия легких сопрягается с вентиляцией легких. Основным сосудистым сегментом, способствующим ВПЧ, является внутриацинарная артерия. Здесь мы описываем наш протокол для анализа ВПЧ мурин легочных сосудов диаметром 20-100 мкм.

Общей целью данной процедуры является анализ гипоксической легочной вазоконстрикции зеркальных внутрилегочных артерий с внутренним диаметром от 20 до 100 микрон. Это достигается путем предварительного заполнения дыхательных путей легких с низкой температурой плавления. Второй шаг заключается в использовании вибратора для разрезания изолированных легких на ломтики толщиной 200 микрон.

Далее арос удаляется из отделов легких путем инкубации при температуре 37 градусов Цельсия, в теплой среде, которая пузырится нормоксическим газом. Таким образом, секции медленно движутся в жидкости. Затем отдельный срез легкого переводится в поток через суперфузионную камеру, после чего проводится видеоморфометрический анализ вазореакции поперечной артерии.

В конечном счете, оцениваются изменения в просветной области сосуда в ответ на различные виды лечения. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как внутривитальная микроскопия субплевральных микрососудов, является измерение сосудистого напряжения в изолированных проксимальных легочных артериях в том, что она позволяет провести количественный анализ реактивности ВА внутрилегочных артерий диаметром от 20 до 100 мкм. Демонстрировать процедуру будут Анна Гольденберг и два домашних техника этой лаборатории.

Сразу после убийства мыши при вывихе шейки матки вскройте брюшную полость, отодвиньте петли кишечника в сторону и перережьте крупные сосуды брюшной полости для кровотечения. Далее с помощью тонких ножниц проникаем в диафрагму. Это приводит к коллапсу легких в результате попадания воздуха в плевральную полость.

Продолжайте резать, чтобы отсоединить диафрагму от нижней грудной апертуры. Теперь разрежьте ребра и ключицу сбоку. Чтобы удалить брюшную часть грудной клетки, удалите вилочковую железу.

Наполните шприц теплым перфузионным буфером. Далее прорежьте небольшое отверстие в левом желудочке сердца. Отрегулируйте отток перфузионного буфера и медленно перфузируйте легочную сосудистую сеть через правый желудочек до тех пор, пока легкие не станут белыми.

Далее удалите из трахеи слюнные железы, мелкие мышцы и соединительную ткань. Отсоедините трахею от окружающей соединительной ткани и вставьте кусочек швейной ваты между пищеводом и трахеей для последующей перевязки. Затем с помощью микроножниц прорежьте небольшое отверстие в верхней части трахеи между двумя соседними трахейными хрящами.

Наполнив шприц 37 градусами Цельсия, теплым, с низкой температурой плавления, подсоедините его к гибкой пластиковой канюле и медленно вдавливайте поршень до тех пор, пока воздух не будет удален из канюли. Вставьте канюлю в небольшое отверстие в трахее и аккуратно закрепите ее на месте с помощью швейной ваты. Далее медленно заполните дыхательные пути с помощью арос и понаблюдайте за легкими.

Сначала начинает расширяться правое легкое, а затем левое. Через 30-40 секунд наполнение завершено, и оба легких надуваются до объема, сравнимого с ситуацией in vivo, который составляет от 1,2 до 2,0 миллилитров. В зависимости от пола, возраста и веса, важно ввести яйцеклетку достаточно быстро, чтобы она не так застыла во время процедуры, но и не настолько быстро, чтобы повредить легкие.

После того, как легкие будут наполнены одновременно, вытащите пластиковую канюлю и перевяжите трахею с помощью швейной ваты, чтобы предотвратить вытекание арос. Впоследствии разрежьте трахею над лигатурой и чтобы отделить легкие и сердце на блоке от грудной клетки, перенесите органы в ледяные кучи рингера буфера для затвердевания агроса, что происходит в течение нескольких минут во время ожидания. Используйте суперклей, чтобы прикрепить кусок пробки от шампанского к держателю образца вибратора, чтобы он действовал как перекос для легочной ткани После того, как агрос затвердеет, разделите отдельные доли легких.

Далее суперклей, одна доля к держателю образца. Чтобы получить поперечные сечения мелких внутриаснерных артерий, возьмите черепную долю правого легкого и суперприклейте ее поверхностью ворот к держателю, используя вибрато, оснащенное свежим лезвием бритвы, нарезанным с периферии, разрезав долю легкого на ломтики толщиной 200 микрон. Чтобы получить поперечные сечения более крупных артерий, выровняйте ворота левого легкого с пробкой от шампанского и приклейте долю в этой ориентации к держателю, а затем срежьте ее с периферии для удаления арос.

Переложите части органа в стеклянный стакан, наполненный примерно 200 миллилитрами 37 градусов Цельсия. MEM помещает стакан в нагревательный шкаф и пузырится с нормоксическим газом, чтобы отделы легких медленно двигались в среде. Примерно через два часа бляшки, наполняющие воздух, будут удалены из легочной ткани, и их срезы осядут на дно стакана.

Для видеоморфометрического анализа внутрилегочных артерий переносят один участок легкого в поток через суперфузионную камеру, которая монтируется на микроскопе и заполняется 1,2 миллилитрами нормоксического газа. МЕМ. Зафиксируйте легочную часть в нижней части камеры с помощью нейлоновых нитей, соединенных с платиновым кольцом. Начните перфузию камеры нормоксической газонасыщенной средой.

Используйте фазово-контрастный микроскоп с 10-кратным объективом для сканирования участка легких на предмет поперечного сечения артерий с внутренним диаметром от 20 до 100 микрон. После того, как подходящий кандидат на сосуд найден, используйте объектив 20 крат, чтобы сфотографировать сосуд, предшествующий аснеру, или, как показано здесь, объектив 40 крат, чтобы сфотографировать внутриаснерную артерию для измерения внутреннего диаметра сосуда. Перед началом эксперимента настройте программное обеспечение так, чтобы оно делало снимки поперечной артерии каждую минуту в течение всего эксперимента.

После запуска фотосъемки продолжайте перфузию камеры нормоксической газовой средой в течение 10 минут. Затем промывают участок легкого в U 466 19 в течение 10 минут без потока, чтобы проанализировать сократительную способность артерии, используя только сосуды, площадь просвета которых была уменьшена не менее чем на 30%. Смойте препарат нормоксической гастной средой в течение 10 минут.

Затем расширьте артерию путем наложения res на 10 минут без слабого кровотока. Снова удалите препарат 10-минутным промыванием нормоксической газообразной средой со скоростью потока шесть миллилитров в минуту, затем через 10 минут с расходом 0,7 миллилитра в минуту. Затем инкубируйте срез легкого с высокогипоксической газовыделенной средой в течение 40 минут.

Также подайте гипоксическую газовую смесь в воздушное пространство перфузионной камеры через дополнительный комплект трубок. Удалите гипоксическую среду с помощью 20-минутной промывки нормоксической газообразной средой и переключите с гипоксического на нормоксический поток газа в воздушное пространство камеры для проверки жизнеспособности сосуда. В конце эксперимента нанесите U 466 19 в перфузионную камеру и инкубируйте в течение 20 минут без потока, чтобы вызвать вазоконстрикцию.

Повторите эти шаги со свежим срезом легкого, чтобы измерить вазореакцию другого сосуда. Начните анализ с загрузки изображений поперечных артерий в программу анализа изображений. Затем с помощью курсора очертите просветную область сосуда.

Сушка рук необходима, так как позволяет избежать артефактов, например, из-за прилипших к сосудистой стенке клеток крови. Продолжайте анализировать изображения поперечного сечения аналогичным образом. Каждое изображение должно быть проанализировано при изменении одного условия в проточной инкубационной камере на другое, но анализ каждого другого изображения достаточен, когда условия не меняются.

Гипоксическая вазоконстрикция легочной артерии наблюдается на этих фазово-контрастных изображениях поперечно разделенной пре-ASIN артерии, которая проходит в непосредственной близости от бронха с поперечным сечением. Снимки сделаны в моменты времени, обозначенные кружками на графике в начале измерения, в конце измерения с U 466 19 в конце воздействия РА через 30 или 40 минут в гипоксической газообразной среде после промывки нормоксической газообразной средой, и после окончательного применения U 466 19 вазореакционная способность регистрируется в виде относительных изменений площади просвета в поперечном сечении артерия против времени. Площадь в начале эксперимента определяется как 100%, а вазоконстрикция задается в виде значений относительно исходной площади.

В этом случае воздействие гипоксии вызывает уменьшение площади просвета на 60% для более четкого проявления гипоксической реакции. Начальная фаза эксперимента, в которой проверялась реактивность протокатора, здесь не показана, а значение, полученное непосредственно перед воздействием восстановленного кислорода, установлено на уровне 100%. В данной серии экспериментов с этой целью анализируется влияние сидала, неселективного открывателя митохондриальных А-ТП-чувствительных калиевых каналов, на гипоксическую легочную вазоконстрикцию мелких внутриаснерных артерий.

Срезы инкубируют в гипоксической среде. При отсутствии или присутствии 50 микромолярных сидальных контрольных инкубации проводят в нормоксичной среде гаста для более четкого представления реакции на нормоксию или гипоксию или гипоксию плюс сидал. Значения, полученные непосредственно перед воздействием нормоксической или гипоксической гастовой среды, устанавливают равными 100%. Артерия, подвергшаяся воздействию шишковидной железы, не демонстрирует уменьшения площади, как это делает артерия, инкубированная в гипоксической среде без добавок.

В нормоксической среде изменения в области просвета не обнаруживаются. Записи небольших интра ASIN артерий, подвергшихся воздействию гипоксической гастной среды с 50 микромолярным сидалом или без него, представлены в виде средних значений плюс или минус SEM. На этом графике показаны относительные данные по отношению к значению в начале гипоксической инкубации.

Реакционная способность сосудов не обнаруживается. В срезах легких, подвергшихся воздействию гипоксического газа, среда, содержащая сосудосуживание шишковидной железы, индуцированное U 466 19, препарат не воздействует. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить зеркальную точность, резать срезы легких, и как использовать их для количественного измерения реактивности VA малых внутриазиновых артерий диаметром от 20 до 40 микрометров, которые расположены в точках альвеолярных перегородок, и более крупных преафинских артерий диаметром от 40 до 100 микрометров, которые пролегают рядом с Бронхами и Бронхиоли.