Простой Поведенческая Анализ для тестирования зрительной функции в

Общая цель данной процедуры заключается в проверке зрительной функции головастиков путем регистрации времени, которое животное проводит в той половине тестового резервуара, которая окрашена в черный цвет. Для этого сначала выращивают головастиков до стадий 45–50. Вторым этапом является подготовка резервуара, наполовину окрашенного в черный и наполовину в белый цвет, а также установка камеры для анализа поведения.

Затем поместите второй резервуар с головастиком во внешний резервуар. Для каждого головастика зарегистрируйте поведение, управляемое зрением, при изменении фона в его среде. Заключительным этапом является проведение ретинальной эксодомии у головастиков с последующим повторным проведением анализа поведения.

В конечном итоге данные этого простого и недорогого анализа используются для того, чтобы показать, что головастики при тестировании фототопического зрения предпочитают плавать на одной стороне аквариума больше, чем на другой. Основным преимуществом использования данного метода по сравнению с другими методами, такими как оптикинетическая реакция или анализ переворота хвоста, является то, что это недорогой и простой способ, использующий оборудование, доступное в большинстве лабораторий opus. Для подготовки головастиков сначала возьмите оплодотворенные эмбрионы xenopus, поместите раствор Маркса, модифицированный раствор Рингера или MMR, разведенный в 10 раз, в чашки Петри диаметром 60 мм с концентрацией 50 µg/mL.

Поместите эмбрионы от стадии бластулы до стадии нервной пластинки в раствор с антибиотиком гентамицином. Содержите их на стадиях с 2 по 15 при температуре 18 °C в чашках Петри. Как только эмбрионы достигнут стадии формирования нейральной чаши (примерно 27–30), перенесите их в 0,1 XMMR без антибиотиков для обеспечения роста кишечных бактерий.

Когда головастики достигнут стадии кормления (примерно 45-я стадия), перенесите их в чашки Петри диаметром 100 мм с 0.1 XMMR. На следующий день скормите им супернатант порошка крапивы. Через одну неделю пребывания в чашке Петри диаметром 100 мм наполните резервуар объемом полгаллона водой для лягушек.

Переместите животных в аквариум и продолжайте график кормления супернатантом порошка крапивы, но меняйте воду только два-три раза в неделю. При содержании животных в аквариумах объемом полгаллона поддерживайте цикл «12 часов света / 12 часов темноты» с включением света в 6:00 утра. Перед тестированием поместите аквариум с подопытными животными на белую поверхность минимум на 12 часов (на ночь). Поведенческий анализ следует проводить в тихом месте с низкой проходимостью людей при стандартном флуоресцентном освещении.

Подготовьте две вложенные тестовые емкости объемом по полгаллона, расположив их по внешним углам того, что станет внутренней емкостью. С помощью маркера Sharpie отметьте уровень воды на высоте пяти сантиметров от дна. Также определите наличие любых углублений внутри внутренней емкости.

Заполните их инертным соединением, чтобы головастики не задерживались в них. Теперь обратите внимание на второй внешний бак. Для следующего этапа подготовьте черную изоленту и белую бумажную салфетку.

Используйте клейкую ленту, чтобы закрыть внешнюю сторону одной половины резервуара, и бумажные салфетки, чтобы закрыть внешнюю сторону другой половины, как показано здесь. После подготовки резервуаров установите инокуляционный поворотный стол и поместите на него вложенные друг в друга резервуары. Установите штатив и веб-камеру так, чтобы камера могла снимать внутреннюю часть резервуаров сверху.

Подключите веб-камеру к компьютеру с установленным программным обеспечением для захвата и воспроизведения видео. Включите камеру и подготовьтесь к созданию новой видеозаписи. Затем накройте камеру и резервуары легкой хлопчатобумажной тканью.

Чтобы минимизировать внешние раздражители для головастиков, используйте люксметр и убедитесь, что освещенность под тканью составляет от 35 до 50 кд/м². Начните поведенческий анализ, извлекая внутренний испытательный резервуар. Заполните его водой для лягушек до отметки пять сантиметров.

С помощью сачка перенесите животное из контейнера объемом полгаллона во внутренний испытательный резервуар у компьютера. Убедитесь, что программное обеспечение для записи запущено и ведет запись области тестирования для последующего учета. Запишите имя животного, дату и время на листке бумаги.

Поместите это под камеру для записи. После этого установите таймер на две минуты. Затем расположите внешний бак на поворотном столе так, чтобы черная сторона находилась справа.

Теперь поместите тестовый резервуар во внешний резервуар. В зоне записи закройте занавес и по экрану компьютера проверьте ориентацию внешнего резервуара. Убедитесь, что ведется запись видео, и запустите таймер.

Когда прозвучит сигнал таймера, не перемещая драпировку, извлеките внутреннюю тестовую кювету. Затем поверните внешнюю кювету на 180 градусов так, чтобы черная сторона оказалась слева. Верните тестовую кювету во внешнюю кювету и запустите таймер на две минуты.

Снова извлеките внутренний бачок. Поверните внешний бачок на 180 градусов и заменяйте внутренний бачок каждые две минуты, повторив эту процедуру в общей сложности 10 раз. По завершении остановите запись видео.

Верните головастика в резервуар объемом полгаллона. Подготовьте микроскоп для проведения ретинол-эксосомии. Заполните чашку Петри диаметром 60 мм 1% раствором agarose, расплавленным в 0.1 XMMR, и дайте ему затвердеть.

Отрежьте от агарозы небольшой прямоугольный кусочек размером с головастика. Когда будете готовы продолжить, достаньте подопытное животное и поместите его в 0,02% раствор Trica. Продолжайте процедуру, когда животное перестанет реагировать на зажим хвоста пинцетом номер три.

Затем перенесите животное в чашку. Установите чашку Петри на микроскоп. Приготовьтесь зафиксировать животное пинцетом с одной стороны.

С противоположной стороны с помощью иглы 25 gauge проколите кожу за дорсальной областью глаза под углом 45 градусов, осторожно введите в отверстие пинцет № 5 и перережьте зрительный нерв, стараясь не задеть прилегающую к нему вену. Отодвиньте нерв в сторону и извлеките пинцет после завершения операции. Для восстановления животного поместите его в чашку Петри диаметром 100 millimeter с 0.7 XMMR и 50 micrograms per milliliter.

Гентамицин в течение 20 минут. После этого перенесите головастика в резервуар для восстановления с водой для лягушек. Поместите резервуар на белую поверхность для подготовки к тестированию.

Оставьте животное отдохнуть на ночь. На следующее утро проведите поведенческий тест для оценки зрительной функции. В данном видео представлены репрезентативные данные эксперимента.

Слева представлены животные до операции, справа — те же животные после перерезки ретинальных аксонов обоих глаз. Это показано на схемах в нижних углах. Вода была потревожена, чтобы продемонстрировать, что в нее не добавляли никаких веществ, которые могли бы отпугнуть животных от черной стороны или привлечь их к белой стороне.

Головастики до операции реагируют на цвет фона менее чем за 30 секунд, в то время как слепые головастики бесцельно плавают по аквариуму. На этом графике показан процент времени, проведенного в белой и черной зонах для одного животного при трех различных условиях. Сначала за животным наблюдали с помощью данного анализа до проведения какой-либо операции.

В течение двух дней подряд после перерезания правого зрительного нерва проводилось наблюдение за поведением животного. Затем, после перерезания обоих зрительных нервов, следовало еще два дня наблюдений с использованием данного метода анализа. Животное проводило больше времени на белой стороне резервуара, когда по крайней мере один зрительный нерв оставался неповрежденным.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проверять зрение головастиков, используя простые реагенты и оборудование, имеющиеся в большинстве лабораторий по изучению лягушек. Желаем удачи в ваших экспериментах.