Простой Поведенческая Анализ для тестирования зрительной функции в Xenopus Laevis

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы проверить зрительную функцию головастиков путем записи количества времени, которое животное проводит на половине тестового аквариума, покрытого черным цветом. Это достигается путем предварительного выращивания головастиков до стадий 45-50. Второй шаг — установить наполовину черный, наполовину белый аквариум вместе с камерой для поведенческого анализа.

Далее поместите второй бак с головастиком во внешний бак. Для каждой записи головастика изменяется поведение, управляемое зрением в качестве фона в окружающей среде. Последним шагом является проведение содомии сетчатки на головастиках, а затем повторение поведенческого анализа.

В конечном счете, данные этого простого, недорогого анализа используются, чтобы показать, что головастики предпочитают плавать на одной стороне аквариума, а не на другой, при тестировании фототопового зрения. Основное преимущество использования этого метода по сравнению с другими методами, такими как оптический кинетический отклик или анализ подбрасывания хвоста, заключается в том, что это недорогой и простой метод, в котором используется оборудование, легко доступное в большинстве лабораторий opus. Чтобы подготовить головастиков, сначала достаньте оплодотворенные эмбрионы ксенопуса, положите в 10-миллиметровые чашки Петри с 50 микрограммами на миллилитр.

Антибиотик гентамицина помещает бластулу на нервную пластинку стадии эмбрионов. Стадии со второй по 15 при 18 градусах Цельсия в чашках Петри. Как только эмбрионы достигнут новой чашки благоприятной стадии примерно от 27 до 30, переключите их на 0,1 XMMR без антибиотиков, чтобы обеспечить рост кишечных бактерий.

Когда головастики достигнут стадии кормления примерно на 45-й стадии, переместите их в 100-миллиметровые чашки Петри с 0,1 XMMR. На следующий день накормите их порошком надосадочной жидкости из крапивы. Через неделю в 100-миллиметровой чашке Петри наполните полгаллонного бака водой для лягушек.

Переместите животных в аквариум и продолжайте режим кормления надосадочной жидкостью с порошком крапивы, но меняйте воду только два-три раза в неделю. Когда животные находятся в полугаллонных резервуарах, поддерживайте их в 12-часовом солнечном 12-часовом темном цикле с включением света в 6:00 утра Перед тестированием поместите полугаллонный аквариум с испытуемыми на белую поверхность на ночь не менее чем за 12 часов до тестирования. Поведенческий анализ следует проводить в тихом месте с низким уровнем движения и стандартным флуоресцентным освещением.

Подготовьте два вложенных испытательных резервуара на полгаллона во внешних углах того, что будет внутренним резервуаром. С помощью шарпи отметьте ватерлинию на высоте пяти сантиметров над дном. Также для внутреннего резервуара определите все углубления в его внутренней части.

Заполните их инертным составом, чтобы головастики не задерживались в них. Теперь обратите внимание на второй внешний бак. Для следующего шага приобретите черную изоленту и белую папиросную бумагу.

Используйте ленту, чтобы покрыть внешнюю сторону одной половины аквариума, и папиросную бумагу, чтобы покрыть внешнюю сторону другой, как показано здесь. Как только резервуары будут подготовлены, установите поворотный стол для прививки и поместите на него вложенные резервуары. Расположите штатив и веб-камеру так, чтобы камера могла видеть внутреннюю часть резервуаров сверху.

Подключите веб-камеру к компьютеру с помощью программного обеспечения для захвата и воспроизведения видео. Включите камеру и приготовьтесь к новой видеозаписи. Затем накиньте легкую хлопчатобумажную ткань на камеру и бачки.

Чтобы уменьшить внешние сигналы на головастиков, используйте измеритель яркости и убедитесь, что яркость под тканью составляет от 35 до 50 свечей на квадратный метр. Начните анализ поведения с извлечения внутреннего испытательного резервуара. Наполните его водой для лягушки до пятисантиметровой отметки.

Используйте сетку, чтобы переместить животное из контейнера объемом в полгаллона во внутренний испытательный резервуар на компьютере. Убедитесь, что программное обеспечение для записи открыто, и запишите тестовую зону для ведения записей. Напишите на листе бумаги имя животного, дату и время.

Поместите его под камеру для записи. После того, как это будет сделано, заранее установите таймер на две минуты. Далее сориентируйте внешний бак на поворотном круге, чтобы черная сторона была справа.

Теперь поместите тестовый бак во внешний бак. В зоне записи закройте драпировку и с помощью экрана компьютера убедитесь в ориентации внешнего бака. Убедитесь, что видео записывается, и запустите таймер.

Когда таймер подаст звуковой сигнал, удерживайте драпировку в нужном положении и снимите внутренний тестовый бак. Далее поверните внешний бак на 180 градусов так, чтобы черная сторона оказалась слева. Верните тестовый бак во внешний бак и запустите двухминутный таймер.

Снова снимите внутренний бачок. Поверните внешний бак на 180 градусов и заменяйте внутренний бак каждые две минуты, в общей сложности 10 раз. Когда закончите, остановите запись видео.

Верните головастика в его полгаллонного бака. Подготовьте микроскоп для выполнения ретинола ex sодомии. Наполните 60-миллиметровую чашку Петри 1%aros, расплавленным в 0,1 XMMR, и дайте ему застыть.

Удалите небольшой прямоугольный кусочек ароса размером с головастика. Когда все будет готово, достаньте подопытное животное и поместите его в 0,02%Трику. Продолжайте, когда он не реагирует на защемление хвоста, с помощью щипцов номер три.

Затем переложите животное в блюдо. Установите чашку Петри на микроскоп. Приготовьтесь обхватить животное щипцами с одной стороны.

С противоположной стороны с помощью иглы 25 калибра проколите кожу за тыльной областью глаза под углом 45 градусов, осторожно дотянитесь до отверстия с помощью номера пять, щипцами и перережьте зрительный нерв, избегая при этом вены рядом с ним. После операции переверните нерв и втяните щипцы. Восстановите животное, поместив его в 100-миллиметровую чашку Петри с 0,7 XMMR и 50 микрограммами на миллилитр.

Гентамицин в течение 20 минут. После этого переложите головастика в восстановительную емкость с водой для лягушки. Поместите бак на белую поверхность для подготовки к тестированию.

Дайте животному отдохнуть на ночь. На следующее утро используйте поведенческий анализ для проверки зрительной функции. В этом ролике представлены репрезентативные данные для эксперимента.

Слева – животные до операции, справа – те же животные после того, как были разорваны аксоны сетчатки обоих глаз. На это указывает схема в нижних углах. Воду потревожили, чтобы показать, что ничего не было добавлено, чтобы отпугнуть животных с черной стороны или привлечь их на белую сторону.

Предоперационные головастики реагируют на цвет фона менее чем за 30 секунд, в то время как слепые головастики бесцельно плавают вокруг аквариума. На этой диаграмме показано процентное соотношение времени, проведенного в белой и черной областях для одного животного в трех условиях. Во-первых, животное наблюдалось перед любым хирургическим вмешательством с использованием анализа.

В течение двух дней подряд после разрыва правого зрительного нерва его поведение наблюдалось в течение двух дней тестирования. Наконец, после того, как оба зрительных нерва были разорваны, было еще два дня наблюдения с анализом. Животное проводило больше дней на белой стороне аквариума, когда хотя бы один зрительный нерв был цел.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проверить зрение головастиков с помощью простых реагентов и оборудования, которое можно найти в большинстве лабораторий по изучению лягушек. Удачи в ваших экспериментах.