Ножевое ранение Травма данио рерио взрослых мозге: Метод по расследованию позвоночных мозг нейрогенеза и Регенерация

Общая цель данного эксперимента заключается в изучении клеточного ответа и молекулярных механизмов, участвующих в нейрогенезе взрослого человека, а также в регенерации и восстановлении центральной нервной системы. У рыбок данио это достигается в первую очередь путем ручного создания травмы путем прокола правого головного полушария взрослой рыбы данио. Затем, через пять дней после травмы, рыбу приносят в жертву, а ее мозг препарируют и помещают в арос для разреза в оме.

Затем отделы мозга окрашивают методом иммуногистохимии или при С двух гибридизациях с соответствующими маркерами. Для наблюдения за пролиферацией клеток, глио, агенезией и нейрогенезом получены результаты, которые показывают повышение регуляции маркера пролиферации PCNA, радиоглиального маркера S 100 beta и двух меченых EGFP клеток-предшественников олигодендроцитов, меченных в зоне желудочков после ножевого ранения. Основным преимуществом этой методики перед существующим методом трансгенной абляции является ее простота, скорость и причинно-специфическая эффективность, что позволяет производить множество поврежденных головных мозга за короткое время.

После обезболивания взрослых рыбок данио, согласно текстовому протоколу, поместите отдельных рыб в щель в блоке трики пропитанной папиросной бумагой под препарирующим микроскопом со светом сверху. Аккуратно держите рыбу одной рукой и ориентируйте ее таким образом, чтобы обеспечить доступ к голове сверху с помощью шприца, оснащенного иглой 30 калибра. В другой руке протолкните иглу вертикально через череп, не глубже двух миллиметров в медиальную область одного из головных полушарий.

После внесения черепной травмы поместите рыб в пресную рыбную воду. Когда все будет готово, переведите рыбу обратно в систему потока воды. Дав рыбам восстановиться за нужный промежуток времени и усыпив их согласно текстовому протоколу, принесите их в жертву на льду и с помощью острых ножниц разрежьте за жабрами, чтобы отделить голову от тела.

Инкубируйте головки в одном XPBS в течение пяти минут, чтобы дать возможность обескровиться. Затем переведите головки в 4%-ный параформальдегид в PBS и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия или в течение четырех часов при комнатной температуре после фиксации. Используйте одну XPBS в чашке Петри, чтобы дважды вымыть голову.

Затем под препарирующим микроскопом тщательно препарируйте мозг в PBS. Отбракуйте любые мозги без видимого поражения. Перенесите мозги в две миллилитровые реакционные трубки, наполненные 1,5 миллилитрами 100% метанола, и переверните пробирки пять раз, прежде чем инкубировать их при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение не менее 16 часов.

Чтобы регидратировать ткань для иммуногистохимии, инкубируйте мозг в течение пяти минут каждый в нисходящем ряду метанола, прежде чем использовать PBS tween 20 или PTW для пятикратной промывки мозга. По пять минут каждому. Далее, чтобы встроить мозги, с помощью переводной пипетки поместите их в полости полиэтиленового формовочного стаканчика Растворите 2% агроса в одном XPBS, нагрев его в микроволновой печи при мощности 600 Вт.

Перед использованием дайте агросу остыть в течение трех минут. Затем осторожно удалите PTW из одного мозга, прежде чем использовать aros для полного заполнения формы. Используйте иглу для вскрытия, чтобы закрутить мозг в арос, чтобы смыть PTW и ориентировать мозг вентральной стороной вниз дорсальной стороной вверх и расположить прямо, прежде чем дать агросу остыть.

С помощью иглы для рассечения извлеките блок агроса из формы. Затем острым лезвием бритвы разрежьте агрос параллельно когтистому головному мозгу на заднем конце мозга. Теперь разрежьте агрос на переднем конце мозга, прежде чем перевернуть блок так, чтобы он стоял на задней плоскости.

Удалите излишки агро, сделав надрезы параллельно дорсальной и вентральной сторонам мозга. Затем переверните мозг назад так, чтобы он лег на вентральную сторону. Наконец, разрежьте блок на усеченный треугольник, в котором цефалон расположен на меньшей плоскости.

После подготовки виоме в соответствии с инструкциями производителя используйте один XPBS для заполнения буферной ванны так, чтобы он доходил только до дна лезвия. Далее поместите небольшую точку суперклея на верхнюю часть диска образца вибратора. Затем аккуратно поместите плоскость блока, который находится позади мозга на суперклей.

С помощью манипулятора микротома вставьте диск для образцов в буферный лоток и поверните диск для образцов в нужное положение. Затем с помощью трехмиллиметрового шестигранного ключа затяните винт и снимите манипулятор. Поместите блок в буферную ванну так, чтобы головной мозг лежал прямо под поверхностью, а дорсальная сторона мозга была обращена к лезвию, чтобы разделить мозг.

Подготовьте 24-луночную пластину для сбора срезов, добавив по одному миллилитру блокирующего буфера на мозг в лунки пластины с вибрирующим микротомом. Начните резку с толщины 50 микрометров, скорости один миллиметр в секунду и частоты 70 герц. С помощью синтетической щетки возьмите тонкие ломтики арос, когда они сходят с лезвия, и соберите их в 24-луночную пластину.

Для проведения иммуногистохимии блокируют неспецифические участки на один час при комнатной температуре. После инкубации удалите буфер и добавьте 250 микролитров антител, разведенных в блокирующем буфере, инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия или в течение двух часов при комнатной температуре, прежде чем использовать PTW, промыть образцы три раза по одной минуте каждый. После инкубации и вторичные антитела в течение двух часов при комнатной температуре.

Вымойте срезы три раза. Для монтажа секций используйте водорастворимую нефлуоресцентную монтажную среду. Затем проанализируйте образцы под составным или конфокальным микроскопом.

При правильном выполнении рана ведет к каналу поражения, который простирается от дорсального к вентральному через палам головного мозга и заживает через 35 дней. Ранее это было показано с помощью иммуногистохимии. Это ранение вызывает повышение регуляции PCNA и S 100 бета и перекрывающийся паттерн через три-семь дней после поражения, что указывает на пролиферацию радиальных глиальных клеток.

На этом рисунке показано временное накопление клеток-предшественников олигодендроцитов или OPC в непосредственной близости от колотой раны, индуцированной у трансгенных олиг двух рыб FP ЭЭГ, которое больше не наблюдается на 35-й день после поражения. Если поражение не введено должным образом, канал поражения не будет виден. Повышение регуляции PCNA и S-100 бета или накопление OPC не обнаруживается.

Как представлено здесь, системный скрининг экспрессии, который сравнивает регуляторы транскрипции в мозге рыб с поражениями и мозга дикого типа, выявил ряд факторов, которые экспрессируются в телемозге и которые активируются в ответ на травму. Метод ступенчатой раны в комбинации, например, с глубоким секвенированием РНК и/или гибридизацией in situ, может помочь идентифицировать новые гены, участвующие в нейрогенезе, регенерации и репарации взрослых рыбок данио