Выделение и количественный Иммуноцитохимическая Характеристика первичных Миогенные клеток и фибробластов из человеческих скелетных мышц

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы разделить две основные клеточные популяции, полученные из образцов биопсии мышц человека, с высокой эффективностью и выходом, позволяющим оценить специфические фенотипические маркеры и маркеры транскрипционного фактора. Это достигается путем первой диссоциации образца биопсии мышц человека в суспензию одной клетки на втором этапе. После семидневного культивирования клетки разделяются с помощью иммуномагнитных шариков, сортирующих на CD 56 положительные, которые являются миогенными клетками, и CD 56 отрицательные фракции, которые являются фибробластами.

Затем клетки окрашивают и визуализируют на предмет желаемых фенотипических и белковых маркеров, представляющих интерес. В конечном счете, иммунофлуоресцентная микроскопия и количественный анализ изображений могут быть использованы для измерения интенсивности выбранных локализованных ядерных факторов транскрипции в отсортированных клеточных популяциях. Основные преимущества этого метода, в котором используется иммуномагнитная сортировка клеток по сравнению с существующими методами, такими как флуоресцентная активированная сортировка клеток, заключаются в том, что он щадящий, позволяет превосходно сортировать первичные мышечные клетки человека с высокой производительностью и жизнеспособностью и может быть выполнен быстро.

Применение этого метода распространяется на расширение нашего понимания клеточной основы фиброзно-жировой мышечной дегенерации, наблюдаемой при старении, а также при ряде мышечных патологий. Сначала определите вес образца ткани, а затем набухните мышцу в базальной среде несколько раз, чтобы промыть образец от лишней крови. Дайте мышце отсадиться при комнатной температуре в течение 30-60 секунд, а затем отсасывайте все, кроме последних двух-трех миллилитров среды из трубки.

Затем переверните трубку на стерильную чашку Петри, чтобы оставшаяся жидкость могла перенести мышцу на чашку. Теперь очистите образец от любых видимых кусочков любого видимого жира или соединительной ткани. Затем поверните чашку, чтобы мобилизовать оставшуюся среду, а затем аспирируйте все среды и добавьте три миллилитра одной коллагеназы и раствора фермента Дисбе на 100-400 миллиграммов ткани, и разрежьте мышечный образец на очень маленькие кусочки размером от одного до двух миллиметров.

Когда проба достаточно измельчена. С помощью широкой пипетки на 25 миллилитров перенесите фрагменты ткани и ферментный раствор в стерильную коническую трубку объемом от 10 до 20 миллилитров. Промойте пластину еще тремя миллилитрами ферментного раствора, а затем с помощью пипетки объемом 10 миллилитров перенесите оставшиеся фрагменты мышц в трубку.

Поместите трубку при температуре 37 градусов Цельсия на 60 минут. Повторное вливание тканевой суспензии каждые 15 минут с помощью пипетки объемом 10 миллилитров. Затем прекратите ферментативную диссоциацию по меньшей мере эквивалентным количеством свежей подогретой питательной среды.

Затем пропустите клеточную суспензию через фильтр 100 микрометров, чтобы удалить любые крупные куски мусора, а затем центрифугируйте ячейки для восстановления. Суспензируйте гранулу в семи-восьми миллилитрах питательной среды, а затем инкубируйте клетки в непокрытой колбе для культуры тканей T 25. 37 градусов по Цельсию с 5% углекислого газа в течение семи дней.

В конце недели трипсин просматривает монослой клеток в течение трех минут. Когда клетки отделятся, добавьте от 5 до 10 миллилитров скелетных мышц, чтобы предотвратить переваривание, и нанесите гранулы на клетки центрифугированием. Затем, после подсчета, зарезервируйте часть клеток для определения маркеров клеточной линии и промойте оставшиеся клетки в 15 миллилитрах силы центрифуги PBS.

На этот раз повторно суспендируйте гранулу в 170 микролитрах при максимальной комнатной температуре в сортировочном буфере и аккуратно доведите пипеткой до реза. Суспендируйте клетки в дозе 35 микролитров хорошо перемешанных магнитных микрогранул с антителами против CD 56. Смешайте клеточный раствор несколько раз с помощью пипетки и выдержите смесь в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия при щадящей растительности.

На полпути после инкубации промойте ячейку и раствор шариков 10 миллилитрами сортировочной буферной центрифуги и реусом. Суспензируйте гранулу в одном миллилитре свежего сортировочного буфера. Затем смажьте сепарационный фильтр и колонну 500 микролитрами буфера источника.

А затем сразу же перемешать и пропустить весь один миллилитр клеточной суспензии через фильтр предварительного разделения и в колонку, трижды промыть колонку одним миллилитром исходного буфера Power Wash, собрав незадерживающуюся фракцию фибробластов, пропустив через колонку в стерильную 50 миллилитровую коническую трубку, содержащую небольшое количество питательной среды. Затем снимите колонку с магнита и нажмите на поршень в верхней части колонки, чтобы собрать фракцию положительных клеток CD 56. В отдельной конической трубке объемом 50 миллилитров, содержащей теплый рост, на этой ступени выделяется среда среднего роста.

Если необходимо провести двойную сортировку, то рассмотрим положительные и отрицательные собранные фракции клеток. Если для получения дополнительной чистоты требуется двойной источник, не помещайте фильтрующий материал в пробирку для сбора положительного сигнала CD 56 на первом сорте, а повторите шаги, начиная с смазки фильтра и колонки в соответствующей экспериментальной конечной точке. Зафиксировать CD 56 положительные клеточные культуры в их культуральной среде, используя эквивалентный объем ледяного 8% параформальдегида.

10 минут с нежной растительностью. Затем аспирируйте фиксатор и дважды промойте клетки PBS для иммуноокрашивания антигенов клеточной поверхности. Заблокируйте клетки по крайней мере на один час в 1% BSA в PBS, а затем пометьте клетки соответствующими первичными, а затем вторичными антителами.

Оптимизируйте усиление детектора, мощность лазера и настройки экспозиции, соответствующие вашему микроскопу и окрашиванию. Перед визуализацией клетки получают изображения клеток в нужном количестве каналов обнаружения и в более чем шести различных полях зрения. Для анализа откройте соответствующие файлы изображений TIFF и перетащите изображения друг в друга, чтобы наложить соответствующие каналы.

Каждый канал будет отображаться как отдельный слой на панели слоев. Затем в окне анализа выберите «Выбрать точки данных», а затем «Пользовательский» и выберите нужные измерения. Чтобы проанализировать интенсивность ядерной флуоресценции, откройте диалоговое окно цветового диапазона и выберите образцы цветов из выпадающего меню.

Затем, удерживая клавишу Shift, выберите тона, характерные для помеченных ядер. Нажмите кнопку «Сохранить», чтобы сохранить эту маску выбора цветового диапазона для использования с другими изображениями, выбранными в том же сеансе. После того, как ядра будут выбраны, нажмите и выберите заливку.

Затем выберите черный цвет в выпадающем меню и подтвердите, что непрозрачность установлена на 100%Далее, нажмите выбрать и инвертировать. Затем щелкните правой кнопкой мыши и снова выберите «Заполнить», а затем выберите белую заливку из выпадающего меню. Выполните алгоритм водораздела, чтобы отделить любые частично перекрывающиеся ядра на теперь уже бинарном ядерном слое.

Перейдите к выделению затем цветового диапазона, а затем теней к выделению отдельных отделенных ядер. Затем перенесите выделение на слой, содержащий 16-битное изображение нужного маркера в оттенках серого, и нажмите кнопку «Записать измерения». Наконец, экспортируйте выбранные измерения в виде текстовых файлов в соответствующее аналитическое программное обеспечение для дальнейшей обработки нефти.

Красное окрашивание очищенных клеточных популяций в сочетании с иммуноокрашиванием на адипогенные и миогенные маркеры линии показывает, что только фракция фибробластов способна к эпигенной дифференцировке с массивным накоплением жира фибробластами, видимым невооруженным глазом, и с дальнейшей демонстрацией их полной трансформации за счет сильной экспрессии ядерного альфа-излучения PPAR этими клетками к 15-му дню лечения. эти клетки высвобождают любой оставшийся антиген соединительной ткани TE 7 A на свой субстрат. В отличие от этого, миогенные клетки сохраняют свой нормальный фенотип, включая экспрессию десмина и тяжелой цепи миозина, без повышения экспрессии ядерного гамма-излучения PPAR. На этом рисунке показан пример количественного анализа поля положительных миогенных клеток Десмонда и поля, из которого были получены эти данные, иллюстрирующий вариацию миогенной экспрессии в отдельных ядрах при этой конкретной плотности посева и в этот момент времени.

На этом графике показана полезность метода для прямого сравнения уровней транскрипционного фактора в различных типах клеток на уровне клетки. Например, эти CD 56 отрицательные мышечные фибробласты экспрессируют высокий уровень ядерного адипогенного транскрипционного фактора, PPAR гамма, в то время как различные CD 56 положительные миогенные клетки поддерживают только очень низкие уровни фактора транскрипции ядерных рецепторов после воздействия среды, индуцирующей адипоциты. Этот метод позволяет исследователям в области биологии мышц исследовать механизмы принятия решений о судьбе клеток в здоровых или патологических образцах мышц человека.

После просмотра этого видео у вас должно быть, во-первых, хорошее понимание того, как получить высокие выходы очищенных и хорошо охарактеризованных мышечных клеток человека, а во-вторых, как проводить объективный количественный анализ клеточных компонентов, идентифицированных с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания.