Разработка В пробирке Модельной системой для изучения взаимодействия Equus Caballus IgE с рецептором с высоким сродством FcεRI

Общей целью данного эксперимента является измерение количества IgE-зависимого высвобождения медиатора из клеток RAD-базофильного лейкоза. Симптомы аллергии вызваны высвобождением медиаторов, таких как гистамин. Гистамин не является единственным медиатором, высвобождаемым базофилами тучными клетками.

Совокупность всех медиаторов, которые высвобождаются этими клетками, приводит к признакам и симптомам немедленной и отсроченной гиперчувствительности. Теперь люди не единственные организмы, которые страдают от аллергии, собаки и лошади тоже страдают. Для дальнейшего развития исследований и поиска методов лечения аллергии, таких как вакцины, требуется анализ высвобождения для количественной оценки количества медиаторов, высвобождаемых в результате исследуемого лечения, если таковые имеются.

Именно по этой причине был проведен данный анализ на высвобождение. Медиатор RBL был впервые разработан и опубликован Яном и Хуком в 1986 году. Позже он был разработан для системы DOC, а теперь и для системы для лошадей.

Модификации так же просты, как изменение интересующих белков. Новостью о клеточной линии стала клеточная линия Rat Baso leukemia или RBL two H 3.1, экспрессирующая альфа-цепь рецепторов Serin R one с высоким FNT ffc до клеточной плотности 500 000 клеток на миллилитр. Добавьте интересующее вас антитело IgE в конечную концентрацию один нанограмм на миллилитр.

Добавьте 100 микролитров смеси в 96 почвенную пластину и выдерживайте 16 часов при температуре 37 градусов. Это позволяет клеткам прилипать к поверхности лунки, а антитело связывается с его рецепторной промывкой. В два раза больше среды, содержащей оставшееся несвязанное антитело, и мертвые клетки со 100 микролитрами теплого 37 градусов высвобождают буфер.

Выбросьте буфер от последней стирки и замените его 100 микролитрами интересующего антигена в интересующей концентрации. После 20-минутной инкубации при температуре 37 градусов перенесите 50 микролитров натина SUP, содержащего медиаторы высвобождения, в новую лунку и замените оставшуюся надосадочную жидкость 50 микролитрами буфера Triton X, чтобы обработать клетки и высвободить оставшиеся медиаторы внутри клеток. В 50 микролитрах 2 миллиона моляров бета-hx.

В течение многих дней субстрат растворяется в цитратном буфере. После двухчасовой инкубации при 37 градусах добавьте по 150 микролитров трис-буфера в каждую лунку, сделав лунку желтой. Измерьте поглощение цвета на 405 нанометрах через 16 часов.

Нагрейте буфер для анализа высвобождения, также известный как буфер Яна, до 37 градусов. Также подготавливают градиент концентрации антигена в буфере высвобождения при концентрациях. Ноль 0,1, 1, 10, 100, 1000 и 10 000 нанограмм на миллилитр.

Затем прогрейте до 37 градусов. Вымойте лунки, быстро перевернув посуду, чтобы удалить фильтрующий материал, и аккуратно добавьте 100 микролитров теплого буфера по направлению к стенкам лунок. Это необходимо для снижения клеточного стресса от разницы температур, что приводит к преждевременному высвобождению медиаторов.

Посуду следует вымыть дважды. Выбросьте буфер для окончательного высвобождения, промойте и добавьте 100 микролитров антигена, начиная с нулевой концентрации антигена в строке A для отрицательного контроля, и, спускаясь вниз по градиенту концентрации от строк B к G и, наконец, к ломтикам Triton X, буферизуйте в строке H. Это для положительного контроля. Выдержите тарелку в течение 20 минут при температуре 37 градусов.

Это точка, где клетки высвобождают медиаторы после инкубационного периода. Перелейте по 50 микролитров жидкости из каждой лунки в соответствующую лунку. В столбцах с 7 по 12 полностью отфильтруйте и отбросьте оставшуюся жидкость в положениях с первого по шестой и замените 50 микролитрами буфера для лизиса Triton X.

Добавьте 50 микролитров подготовленного субстрата во все 96 лунок посуды. Выдерживать при температуре 37 градусов в течение двух часов. Бета Н, много дней превращает субстрат в четыре нитрофенола.

После инкубационного периода остановите реакцию, добавив 150 микролитров трис-буфера, превратив четыре нитрофенола в желтый цвет. Считывание показаний с помощью пластинчатого спектрофотометра на 405 нанометрах. После измерения данных поглощения рассчитайте общее количество медиаторов внутри ячеек в ячейках в положении А единица путем умножения.

Он соответствует колодцу в положении семь на два и прибавляет результат к значению в точке один. Это связано с тем, что во время эксперимента у нас есть супинат, содержащий противодействие медиаторов высвобождения А, так как мы перенесли его в новую оппозицию лунки. Семерка.

Повторите расчеты для остальных скважин. Вычислите процент медиаторов высвобождения в противодействии лунки A seven от рассчитанного общего числа медиаторов внутри ячеек, умножив значение позиции A seven на два. Опять же, потому что во время эксперимента у нас есть супернат, содержащий медиаторы Риза.

Когда мы перенесли его в новое, затем умножаем это произведение на 100 и делим это произведение на соответствующее общее значение медиаторов внутри клеток для этой позиции. Это дает процент медиаторов высвобождения для волны. Повторите расчеты для остальных скважин, так как шесть волн в каждом ряду сталкиваются с одинаковой концентрацией среднего антигена.

Эти значения и вычисление стандартного отклонения отобразите эти значения на графике следующим образом. На графике видно, что по мере увеличения концентрации антигена высвобождается больше медиаторов до тех пор, пока она не достигнет пика в 100 нанограмм на миллилитр, после чего высвобождение медиаторов уменьшается с увеличением концентрации антигена. Окончательный экспериментальный результат должен выглядеть так, как видно на графике В. Анализ контрольного высвобождения, выделенный светло-голубым цветом, не содержит антител IgE и, таким образом, не показывает изменения высвобождения медиаторов с увеличением концентрации антигена.

Сравните это с экспериментальным результатом в темно-синем цвете, который может содержать антитела IgE. Это пример того, как анти-IgE вакцина проходит испытания на безопасность. Из этого графика, выделенного красным цветом, ясно, что анти-IgE сыворотка связывает рецепторы на поверхности клетки, вызывая дегрануляцию клеток RBL, как это видно в положительном контроле фиолетового цвета по сравнению с отрицательным контролем в сером, что делает эту вакцину небезопасной.

Этот анализ очень полезен, поскольку он может измерять высвобождение медиатора или его запаздывание при тестировании потенциальных противоаллергических препаратов или вакцин, которые также могут быть адаптированы для собачьей или лошадиной систем человека, как показано, анализ может определить успешную блокировку или неудачную блокировку высвобождения медиатора при тестировании антиаллергических антител.