Разработка и проверка количественной ПЦР метод для Equid герпесвирусных-2 Диагностика в Респираторные жидкостям

Общей целью метода количественной ПЦР является оценка вирусной нагрузки вируса герпеса лошадей-2 в биологических образцах от лошадей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области диагностики респираторных заболеваний у лошадей, количественные данные о новых интерпретативных вспомогательных средствах для практикующих врачей. Главное преимущество данной методики в том, что она является чувствительным, специфичным и быстрым методом.

Еще одним преимуществом является разработка в соответствии с нормой AFNOR NF U47-600, который является представителем Франции в международном комитете по нормализации. Демонстрировать процедуру будет Эрика Хюэ, молодой исследователь из моего подразделения. Чтобы извлечь нуклеиновые кислоты из биологического образца дыхательных жидкостей, под вытяжной шкаф начинают с добавления 140 микролитров биологического образца в 560 микролитров лизисного раствора и выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут.

Добавьте в образец 560 микролитров этанола и нанесите 630 микролитров общего раствора на колонну с кремнеземом и центрифугу. Нанесите оставшиеся 630 микролитров в колонку с диоксидом кремния и снова центрифугируйте. После того, как образец был нанесен на колонку, используйте по 500 микролитров каждый из промывочных буферов AW1 и AW2 для двукратной промывки колонки.

Затем для элюирования нуклеиновых кислот из колонки добавляют 50 микролитров элюирования комнатной температуры или буфера AVE. Закройте крышку и выдерживайте при комнатной температуре в течение одной минуты. Затем центрифугируйте при 6 000 г в течение одной минуты.

Для амплификации ДНК, после титрования праймеров и зонда в соответствии с текстовым протоколом, приготовьте 22,5 микролитра реакционной смеси для каждой реакции, добавив 12,5 микролитров мастер-смеси для ПЦР, 20 микромоляров прямого и обратного праймеров, 10 микромолей зонда и достаточное количество сверхчистой воды, необходимое для достижения 22,5 микролитров. Во избежание загрязнения всегда готовьте смесь для ПЦР-реакции в определенном месте. Аликвоту 22,5 мкл соответствующей реакционной смеси на каждую реакционную лунку 96-луночного планшета.

Включите отрицательный контроль для экстракции и ПЦР, чтобы гарантировать, что ни один из реагентов не загрязнен нежелательной ДНК. Затем добавьте 2,5 микролитра образца, отрицательного контроля экстракции, отрицательного контроля ПЦР или положительного контрольного образца в соответствующие реакционные лунки. Затем используйте клейкую пломбу для пластины, чтобы покрыть пластину.

И центрифугируйте при 6 000 g в течение 10 секунд. Поместите планшет в систему ПЦР в режиме реального времени. Затем выберите шаблон для макета анализа и настройки программы ПЦР, показанные здесь, и начните прогон.

После переноса исходных данных из системы ПЦР в реальном времени в электронную таблицу установите пороговое значение на графиках амплификации выше базового уровня и в пределах области экспоненциального роста, чтобы получить пороговый цикл для каждого образца. Постройте каждую стандартную точечную кривую в виде стандартной кривой, чтобы получить линейность. Затем рассчитайте количество копий для различных образцов на основе стандартной кривой.

Чтобы определить предел обнаружения результатов qRT-PCR, раздайте 90 микролитров сверхчистой воды в шесть пробирок. Чтобы приготовить шесть десятикратных последовательных разведений плазмиды для нацеливания на зону очистки, начните с переноса 10 микролитров из рабочего разведения плазмиды в пробирку с 90 микролитрами сверхчистой воды. Кратковременно перебейте пробирку и центрифугируйте.

Затем перелейте 10 микролитров из тюбика в следующий тюбик с водой. После вортексирования и центрифугирования повторяйте перенос до тех пор, пока все пробирки с водой не получат плазмиду. После амплификации ДНК в шести десятикратных серийных разведениях, как описано ранее в этом видео, определяют зону ослабления, которая является последним разведением плазмиды, производящим положительный сигнал, и первым разведением без обнаружения.

Чтобы приготовить шесть двойных серийных разведений, раздайте 25 микролитров сверхчистой воды в шесть пробирок. От последнего разведения плазмиды, давшей положительный сигнал, из десятикратных разведений переносят 25 микролитров из пробирки в первую пробирку с водой. Вортекс и центрифугу перед приготовлением оставшихся пяти разведений, как показано выше.

Амплифицируйте ДНК из двойных серийных разведений, как описано ранее в этом видео. После амплификации ДНК из трех независимых исследований Рассчитайте количество положительных репликатов из 24 репликатов для каждого уровня концентрации плазмид. Определите LOD с вероятностью 95 процентов или LOD 95 процентов PCR, что является уровнем, который приводит к обнаружению 23 положительных реплик из 24 реплик.

Для определения LOD метода готовят пять двукратных серийных разведений, начиная с 25 мкл рабочего разведения плазмиды, что в четыре раза концентрируется по сравнению с последней концентрацией при десятикратном разведении, давшем положительный сигнал. Плазмида, используемая на стадии амплификации, получается из рабочего разведения плазмиды, приготовленной в определенной области во избежание загрязнения. Это критически важный шаг.

Перенесите 5 микролитров из каждого разведения плазмиды в четыре пробирки со 135 микролитрами отрицательного ресурсного материала, чтобы получить четыре повторения пяти положительных стандартов. Проведите извлечение четырех реплик для пяти положительных стандартов и выполните процедуру амплификации, как описано ранее в этом видео. Подсчитайте количество положительных репликатов из восьми репликаций для каждого уровня концентрации плазмид.

Наконец, определим метод LOD, который является последним уровнем, на котором восемь репликаций из восьми являются положительными. Метод количественной ОТ-ПЦР, описанный в этом видео, обнаруживает и количественно определяет эквитный герпесвирус-2 в дыхательных жидкостях. В этом эксперименте были проведены десятикратные серийные разведения для оценки зоны ослабления, которая лежит между разведениями 10 до отрицательного 9-го и 10 до отрицательного 10-го.

Значение ПЦР LOD определяли с помощью нового двукратного серийного разведения в зоне выбросов. Для определения диапазона линейности и LOQ PCR значение LOD PCR использовалось для начала диапазона из шести десятикратных серийных разведений от 2,6, значения LOD PCR, до 260 000 копий на 2,5 микролитра образца. ПЦР LOQ имеет самую низкую концентрацию в диапазоне линейности.

Характеризация всего метода представляет собой валидацию всех этапов, необходимых для получения данных qRT-PCR от экстракции ДНК из образца дыхательных путей до амплификации и количественного определения мишени. Количественная эффективность всего аналитического метода qRT-PCR была оценена и валидирована с помощью профиля точности, представленного на этом графике. Вирусный геном EHV2 загружен в 172 образцах мазков из носа от лошадей с респираторными заболеваниями, как показано здесь.

Вирусная нагрузка генома была выше у молодых лошадей, при этом наибольшая нагрузка была обнаружена в 1,9 раза от 10 до 11-х копий на миллилитр. После освоения эта техника может быть выполнена менее чем за два часа на каждом этапе усиления, а общее количество этапов валидации может быть выполнено менее чем за четыре недели, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что следует избегать риска загрязнения, особенно при работе с плазмидным раствором.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как идентификация генома. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить экстракцию и амплификацию ДНК и характеризовать их ПЦР-резервы. Не забывайте, что работа с биологическими образцами, такими как патогены, может быть чрезвычайно опасной.

При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать некоторые меры предосторожности, такие как работа в капюшоне и адаптированная зона безопасности.