Разработка и проверка количественной ПЦР метод для Equid герпесвирусных-2 Диагностика в Респираторные жидкостям

Общая цель метода кПЦР заключается в оценке вирусной нагрузки герпесвируса лошадей 2-го типа в биологических образцах лошадей. Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области диагностики респираторных заболеваний у лошадей, предоставляя количественные данные, которые послужат дополнительным инструментом интерпретации для практикующих врачей. Основным преимуществом данной методики является ее высокая чувствительность, специфичность и быстрота выполнения.

Еще одним преимуществом является разработка в соответствии со стандартом AFNOR NF U47-600, который представляет Францию в международном комитете по стандартизации. Процедуру продемонстрирует Эрика Хью, молодой исследователь из моего подразделения. Чтобы экстрагировать нуклеиновые кислоты из биологического образца респираторных жидкостей, в вытяжном шкафу сначала добавьте 140 µL биологического образца к 560 µL лизирующего раствора и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут.

Добавьте 560 µL этанола в образец, затем нанесите 630 µL общего раствора на силикатную колонку и центрифугируйте. Нанесите оставшиеся 630 µL на силикатную колонку и повторно центрифугируйте. После нанесения образца на колонку промойте её дважды, используя по 500 µL промывочных буферов AW1 и AW2.

Затем для элюции нуклеиновых кислот из колонки добавьте 50 µL элюирующего буфера или буфера AVE комнатной температуры. Закройте крышку и инкубируйте при комнатной температуре в течение одной минуты. Затем центрифугируйте при 6 000 ×g в течение одной минуты.

Для амплификации ДНК, после титрования праймеров и зонда согласно текстовому протоколу, приготовьте 22,5 µL реакционной смеси для каждой реакции, добавив 12,5 µL мастер-микса для ПЦР, 20 µM прямого и обратного праймеров, 10 µM зонда и необходимое количество ультрачистой воды для достижения общего объема 22,5 µL. Чтобы избежать контаминации, всегда готовьте реакционную смесь для ПЦР в специально отведенной зоне. Располируйте по 22,5 µL соответствующей реакционной смеси в каждую лунку 96-луночного планшета.

Включите отрицательные контроли для экстракции и ПЦР, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения реагентов посторонней ДНК. Затем добавьте 2,5 µL образца, отрицательного контроля экстракции, отрицательного контроля ПЦР или положительного контрольного образца в соответствующие лунки с реакционной смесью. После этого закройте планшет адгезивной пленкой.

Затем центрифугируйте при 6, 000 gs в течение 10 секунд. Поместите планшет в систему ПЦР в реальном времени. После этого выберите шаблон схемы расположения анализов и настройки программы ПЦР, представленные здесь, и запустите анализ.

После переноса необработанных данных из системы ПЦР в реальном времени в электронную таблицу установите порог на графиках амплификации выше базовой линии и в пределах области экспоненциального роста, чтобы определить пороговый цикл для каждого образца. Постройте стандартную кривую по точкам стандартного набора для проверки линейности. Затем рассчитайте число копий для различных образцов на основании стандартной кривой.

Для определения предела обнаружения результатов qRT-PCR разлейте по 90 µl ультрачистой воды в шесть пробирок. Чтобы приготовить шесть десятикратных серийных разведений плазмиды для определения зоны снижения сигнала, перенесите 10 µl рабочего разведения плазмиды в пробирку с 90 µl ультрачистой воды. Кратковременно перемешайте содержимое пробирки на вортексе и центрифугируйте ее.

Затем перенесите 10 µL из пробирки в следующую пробирку с водой. После перемешивания на вортексе и центрифугирования повторите перенос до тех пор, пока плазмида не будет добавлена во все пробирки с водой. После амплификации ДНК в шести десятикратных последовательных разведениях, как было описано ранее в этом видео, определите зону снижения, которая представляет собой последнее разведение плазмиды, дающее положительный сигнал, и первое разведение, при котором детектирование отсутствует.

Для подготовки шести двукратных серийных разведений внесите по 25 µl ультрачистой воды в шесть пробирок. Из последней пробирки с разведением плазмиды, давшей положительный сигнал при десятикратных разведениях, перенесите 25 µl в первую пробирку с водой. Перемешайте на вортексе и центрифугируйте перед приготовлением остальных пяти разведений, как было продемонстрировано.

Проведите амплификацию ДНК из двукратных серийных разведений, как было описано ранее в данном видео. После амплификации ДНК из трех независимых повторов рассчитайте количество положительных реплик из 24 реплик для каждого уровня концентрации плазмиды. Определите LOD с доверительной вероятностью 95% или LOD 95% PCR, который представляет собой уровень, приводящий к обнаружению 23 положительных реплик из 24 реплик.

Для определения предела обнаружения (LOD) метода подготовьте пять двукратных серийных разведений, начиная с 25 µL рабочего разведения плазмиды, концентрация которой в четыре раза выше, чем последняя концентрация в десятикратном разведении, давшем положительный сигнал. Плазмида, используемая на этапе амплификации, берется из рабочего разведения плазмиды, приготовленного в специально отведенной зоне для предотвращения контаминации. Это критический этап.

Перенесите по 5 µL каждого разведения плазмиды в четыре пробирки, содержащие по 135 µL отрицательного исходного материала, чтобы получить четыре повторности для каждого из пяти положительных стандартов. Выполните экстракцию четырех повторностей для пяти положительных стандартов и проведите процедуру амплификации, описанную ранее в этом видео. Подсчитайте количество положительных повторностей из восьми повторностей для каждого уровня концентрации плазмиды.

Наконец, определите предел обнаружения (LOD), который представляет собой последний уровень разведения, при котором восемь из восьми повторностей оказываются положительными. Метод количественной RT-PCR, описанный в данном видео, позволяет обнаруживать и количественно определять герпесвирус лошадей 2-го типа в респираторных жидкостях. В данном эксперименте были выполнены десятикратные серийные разведения для оценки зоны затухания, которая находится между разведениями 10⁻⁹ и 10⁻¹⁰.

Значение LOD PCR было определено с помощью нового двухкратного серийного разведения в зоне снижения. Для определения диапазона линейности и LOQ PCR значение LOD PCR было использовано в качестве начальной точки диапазона из шести десятикратных серийных разведений между 2,6 (значение LOD PCR) и 260 000 копий на 2,5 µL образца. LOQ PCR представляет собой самую низкую концентрацию в диапазоне линейности.

Характеристика всего метода представляет собой валидацию всех этапов, необходимых для получения данных qRT-PCR: от экстракции ДНК из респираторного образца до амплификации и количественного определения мишени. Количественные показатели всего аналитического метода qRT-PCR были оценены и валидированы с профилем точности, представленным на данном графике. Было проведено количественное определение вирусной нагрузки генома EHV2 в 172 образцах мазков из носа лошадей с респираторными расстройствами, как показано здесь.

Вирусная нагрузка генома была выше у молодых лошадей, при этом максимальное значение составило 1,9 × 10¹¹ копий на мл. После освоения данная методика может быть выполнена менее чем за два часа на один этап амплификации, а все этапы валидации могут быть завершены менее чем за четыре недели при условии правильного выполнения. При проведении данной процедуры важно помнить о необходимости избегать риска контаминации, особенно при работе с раствором плазмиды.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как секвенирование, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, идентифицировать геном. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить экстракцию и амплификацию ДНК, а также характеризовать их ПЦР-резервы. Не забывайте, что работа с такими биологическими образцами, как патогены, может быть крайне опасной.

При выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как работа в вытяжном шкафу и использование помещений с соответствующим уровнем биобезопасности.