Enhanced приведенного представления Бисульфитное секвенирование по оценке метилирования ДНК в паре оснований резолюции

Общей целью данной процедуры является создание библиотек секвенирования для пар оснований с разрешением D-N-A-C-P-G, анализа метилирования на основе расщепления фермента рестрикции в сочетании с цитозином путем сульфитной конверсии. Это достигается путем первого проведения MSP расщепления одного фермента рестрикции высококачественной ДНК, за которым следует конечная репарация, хвостовое содержание и лигирование метилированных адаптеров. Следующим этапом является выполнение сульфитной конверсии по размеру выбранных фрагментов после сульфитной конверсии.

Фрагменты амплифицируют с помощью ПЦР. Заключительным этапом является выполнение контроля качества и секвенирования, за которым следует визуализация и анализ данных. В конечном счете, улучшенное уменьшенное представление секвенирования бисульфитов обнаруживает количественное разрешение пар оснований паттернов метилирования цитидина в богатых компьютерной графикой геномных локусах.

Основное преимущество этого метода перед другими методами метилирования ДНК, такими как микрочипы, заключается в том, что он может использовать небольшие количества входного материала для получения данных метилирования D-N-N-A-C-P-G с высоким покрытием при разрешении пар оснований и биологически значимых сайтах. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы заинтересовались изучением эпигенетических закономерностей за пределами областей, охваченных традиционными анализами. Мы были заинтересованы в разработке этого метода для перехода от микрочипов к получению данных метилирования ДНК с разрешением пар оснований, которые можно было бы интегрировать с данными, полученными с помощью других методов следующего поколения.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики. Например, эпигенетическая структура и гетерогенность биологических образцов по сравнению с нормальным контролем или другими болезненными состояниями. Как правило, люди, не знакомые с этим методом, найдут его сложным из-за длительности процедуры, многочисленных специфических требований и уникальных характеристик секвенирования библиотек, сгенерированных Mamie fall.

Специалист по исследованиям в нашей лаборатории будет помогать в демонстрации процедуры для начала этого протокола. Во-первых, приготовьте очищенные аликвоты образцов геномной ДНК, которые подверглись перевариванию одного фермента рестрикции MSP, реакции репарации тупого конца и добавлению одного нуклеотида А на трех основных концах. На этом этапе продукты ДНК будут готовы к лигированию адаптера, чтобы начать перенос 10 микролитров образца A-A-L-D-N-A в 0,2-миллилитровую ПЦР-пробирку и поместить пробирку на лед.

Кроме того, поместите аликвоту из молекул адаптера на лед. Далее приготовьте реагентную смесь для лигирования на льду. Добавьте реагент для лигирования и молекулы адаптера к образцу ДНК и несколько раз перемешайте пипеткой вверх и вниз.

Поместите ПЦР-пробирку в термоамплификатор и дайте реакции лигирования протекать в течение ночи при температуре 16 градусов Цельсия на следующий день. Очистите продукты лигирования с помощью набора для экстракции твердофазной ДНК на основе магнитных шариков или кремнеземной колонки. На последнем этапе процесса очищения.

Разбавьте ДНК, добавив 30 микролитров свободной воды из ДНК. Очищенный продукт ДНК может храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока он не понадобится для образцов, которые изначально имели общую ДНК 25 нанограммов или более. Используйте автоматизированный аппарат для экстракции геля, такой как PI, и подготовьтесь для выбора лигированных продуктов длиной от 150 до 400 пар оснований.

Обязательно исключите красители для визуализации ДНК, такие как бромид Ethereum или кибер-зеленый, из кассеты agros, поскольку они могут изменить миграционные свойства ДНК фрагментов, связанных с разветвленным адаптером. Стандартные протоколы выбора размера на основе геля agros также могут быть использованы для этого этапа протокола для настройки электрофореза ДНК на кассете aros с пиппином 2% без красителя. Создайте новый протокол в консоли Pippin Prep и выберите вариант маркера 2%DF L в качестве кассеты.

Затем включите опцию «Использовать внутренние стандарты» и убедитесь, что номер референсной полосы совпадает с номерами полос для выделения фрагментов ДНК в диапазоне от 150 пар оснований до 400 пар оснований. Выберите опцию диапазона в качестве режима сбора и введите следующие предельные параметры: 135 для начала базовой пары, 410 для конца базовой пары и 240 для лап базовой пары. Это дает команду устройству выровнять электрофоретическое поле по выходному порту электроэлюирования.

Когда фрагменты ДНК в пределах этого диапазона перемещаются вблизи выходного отверстия. После сохранения файла протокола подготовьте гелевую кассету и лунки для загрузки проб прибора, следуя стандартным операционным процедурам Pippen Prep при настройке прибора. Подготовьте образцы ДНК к электрофорезу, добавив 10 микролитров маркера ДНК к 30 микролитрам аликвоты данного образца после лигирования, чтобы загрузить смеси в гелевую кассету.

Сначала удалите 40 микролитров буфера для электрофореза из каждого образца. Ну а затем замените объем, пипетируя каждые 40 микролитров образца маркерной смеси в отдельные лунки. Вернувшись в консоль, загрузите сохраненный протокол и нажмите «Старт», чтобы начать электрофорез.

Когда программа достигнет 240 пары оснований, сделайте паузу и вручную соберите 40 микролитров ouit с каждого выходного порта с помощью пипетки. Обозначьте эти дроби как младшую библиотечную дробь. Собрав нижние библиотечные фракции, немедленно промойте выпускные порты, добавив 40 микролитров свежего буфера для электрофореза.

Пипетирование буфера вверх и вниз не менее трех раз, а затем аспирация сетки. Повторите эту промывку еще два раза, чтобы удалить все следы короткой длины ДНК с выходных отверстий. Теперь добавьте в образец 40 микролитров буфера для электрофореза.

Хорошо запечатайте элуцианские порты и нажмите кнопку запуска, чтобы возобновить элуцианский процесс. По завершении программы Эллуциана при настройке пары оснований 410 соберите 40 микролитров инуитского языка из всех выходных портов и пометьте эти дроби как верхнюю библиотечную дробь. К этому моменту обе библиотечные фракции очищены от геля и уже для превращения бисульфита.

Используя коммерчески доступный набор, проведите анализ конверсии бисульфитов на обеих библиотечных фракциях. На заключительном этапе процесса преобразования вымывайте образцы ДНК в 40 микролитрах свободной воды ДНК. После бисульфитной конверсии полученные фрагменты библиотеки ДНК будут подвергнуты обогащенной ПЦР-амплификации с использованием праймеров, которые гибридизуются на концах адаптера каждой молекулы ДНК.

Чтобы подготовиться к обогащению ПЦР, сначала добавьте 160 микролитров мастер-смеси ПЦР на каждые 40 микролитров аликвоты данного сульфидного преобразованного образца. Затем разделите полученную смесь объемом 200 микролитров на четыре аликвоты по 50 микролитров. В отдельных пробирках для ПЦР.

Поместите пробирки в термоамплификатор и амплифицируйте преобразованную матрицу ДНК. После обогащения соберите четыре продукта после ПЦР в одну пробирку объемом 1,5 миллилитра и очистите ДНК с помощью коммерческого набора для очистки ПЦР. Если для очистки продуктов ПЦР используется набор для твердофазной экстракции магнитных шариков, измените стандартные рабочие процедуры, сначала смешав объединенные продукты ПЦР с нижней библиотекой и в 1,7 раза превышающим их общий объем в гранулах.

Затем смешайте объединенные продукты ПЦР верхней библиотеки с 1,1-кратным их общим объемом в гранулах. Затем следуйте протоколу производителя до этапов промывки с содержанием этанола 70%, где каждый из объемов промывки должен быть изменен на 800 микролитров на последнем этапе процесса очистки. Разбавьте ДНК 50 микролитрами буфера для свободного элюирования ДНК.

Храните очищенные библиотеки при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся, используя флуоресцентный анализ, селективный для двухцепочечной ДНК, количественно определяйте количество содержания ДНК после обогащения для каждой библиотечной фракции. Кроме того, оцените размер и качество библиотеки после обогащения с помощью биоанализатора. Рассчитайте эффективную молярность ДНК определенной библиотечной фракции, используя среднюю длину ДНК, выраженную в парах оснований.

Как только молярность будет известна, используйте свободную воду ДНК для разбавления каждой соответствующей верхней и нижней библиотечной фракции до конечной концентрации в два наномоляра. Объедините нижнюю и верхнюю библиотечные пары в одну пробирку, чтобы создать библиотечную смесь из двух наномолярных отверстий по 20 микролитров каждая. Теперь объединенная выборка готова к выполнению секвенирования.

В анализах, связанных с секвенированием, включая E-R-R-B-S, качество и распределение по размерам молекул верхней и нижней библиотеки являются ключевыми факторами при определении качества окончательных данных секвенирования. По сравнению с традиционными протоколами ручной экстракции геля, автоматизированный аппарат для экстракции геля, используемый в протоколе E-R-R-B-S, обеспечит равномерное распределение по размерам и сведет к минимуму вероятность перекрестного загрязнения образца. Далее, после отправки в BIS сульфитных преобразованных библиотечных молекул для секвенирования, исходные данные из всех нитей ДНК показывают, что для любой данной цепи качество данных для каждой позиции нуклеотида резко возрастает сразу после первых трех нуклеотидов.

Поскольку консенсусная последовательность для этих трех нуклеотидов была установлена с CGG для подавляющего большинства библиотечных молекул, данные свидетельствуют о том, что протокол E-R-R-B-S позволил создать библиотечную коллекцию, содержащую желаемый набор фрагментов генома, которые преимущественно фланкированы. С MSP один рестрикционный дайджест заканчивается с высоты птичьего полета. Протокол E-R-R-B-S может давать данные о разрешении пар оснований сайтов метилирования цитидина по всему геному.

Например, здесь показана хромосома 12. Протокол охватывает сокращенную репрезентацию полногеномных CPG. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить библиотеки E-R-R-B-S для генерации данных метилирования базового разрешения D-N-A-C-P-G после освоения этой техники можно сделать за четыре дня при правильном выполнении.

Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить, что нужно начать с высококачественной ДНК, включить в нее все описанные этапы, проверить эффективность конверсии бисульфата и секвенировать с использованием рекомендованных параметров. Не забывайте, что работа с фенилом и хлороформом может быть крайне опасной. При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать общие меры предосторожности, такие как работа в химическом вытяжном шкафу и надлежащая утилизация отходов.

Следуя этой процедуре. Для проверки результатов могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование по спиро или эпитип массива масс. Кроме того, может быть выполнено профилирование экспрессии генов для определения биологической значимости обнаруженных паттернов метилирования ДНК.

Возможность генерировать ДНК с разрешением пар оснований, паттерны метилирования из ограниченного количества входных материалов позволила профилировать популяции редких клеток, что ранее было невозможно. Это также сделало возможным профилирование больших когорт клинических образцов для изучения эпигенетической опосредованной регуляции и гетерогенности заболевания.