Прямая индукция человеческих нервных стволовых клеток из периферической крови гемопоэтических клеток-предшественников

Общая цель этой процедуры заключается в прямом индуцировании нейральных стволовых клеток из клеток крови. Это достигается путем обогащения CD 34 положительными гемопоэтическими прогениторными клетками из крови. Вторым этапом является трансфекция клеток CD 34 вирусом сенди, содержащим транскрипционные факторы.

Затем нейральные стволовые клетки получают с помощью селективной среды. Последним шагом является дифференцировка индуцированных нейральных стволовых клеток в нейроны, астроглии и олигодендроциты. В конечном счете, иммунофлуоресцентная микроскопия используется для характеристики полученных клеток.

Основное преимущество этой методики перед существующим методом, таким как длительность нейронов непосредственно из фибробластов, а также генерация IPS, заключается в том, что этот метод позволяет обойти утомительный процесс генерации и расчета IPS, но при этом обеспечить большое количество нейрональных клеток, которые могут соотноситься, дифференцироваться в нейроны. Впервые у меня появилась идея этого метода, когда я заметил, что прикрепленные трансфицированные клетки CT 34 на самом деле очень похожи на первичные культивируемые нейропрогенные клетки, демонстрирующие процедуру морских пехотинцев, техников из моей жизни. После выделения клеток CD 34 из мононуклеарных клеток периферической крови в соответствии с инструкциями в текстовом протоколе, начните процесс культивирования клеток CD 34 с помощью Resus, суспензируя клетки CD 34 в среде CD 34, затем засейте клетки в 24-луночный планшет в соотношении от трех до 10 до пятых клеток на лунку в одном миллилитре среды.

После инкубации в течение 24 часов в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом соберите плавающие клетки и центрифугируйте клеточную суспензию при 110-кратном перегрузке при комнатной температуре. Затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в свежей поддерживающей среде CD 34. Посмотрите на новый планшет на 24 лунки за один раз с 10 до пятой клетки на лунку в одном миллилитре среды, инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% углекислым газом в течение пяти дополнительных дней, заменяя половину среды через день.

Тщательно отсасывая верхнюю половину надосадочной жидкости, в то время как клетки CD 34 находятся на дне лунок, как показано здесь на пятый день. После гальванизации соберите CD 34 клетки и центрифугируйте клетки при 170 умноженных на G в течение 10 минут при комнатной температуре, выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки, как и засейте свежую 24-луночную пластину в соотношении от 10 до 5 клеток на лунку в один миллилитр среды. Далее разморозьте набор для перепрограммирования cyto tune IPS Sendi.

Сначала погрузите дно трубок в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 10 секунд, а затем полностью оттайте при комнатной температуре. Быстро центрифугируйте пробирки и положите их на лед. Приготовьте Сендайскую вирусную смесь, смешав рекомендуемый объем каждого вируса, указанный в сертификате анализа для соответствующей партии.

Рекомендуется кратность инфекции 15. Добавьте смесь вируса Сендай в каждую лунку с клетками CD 34. Затем перемешайте лунки, аккуратно встряхивая тарелку.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% углекислым газом через 24 часа. Наблюдайте за эффективностью трансдукции. Обратите внимание, что клеточные агрегаты и сферы, подобные показанным здесь, являются индикаторами успешной трансдукции.

Затем инкубируйте клетки в инкубаторе для тканевых культур в течение пяти-семи дней, пока не появятся прикрепленные клетки и не достигнут конфлюенции от 30 до 50%, как показано здесь, через день. Смените половину среды, осторожно переложив верхнюю половину среды в другую лунку. Если клеточные сферы переносятся в новые, хорошо добавить равное количество свежей среды.

Проверьте беглость клеток с помощью инвертированного микроскопа. Когда клетки сливаются на 30-50%, аспирируйте надосадочную жидкость и резерв, а затем добавьте по одному миллилитру нейральной среды-предшественника в каждую лунку, чтобы сделать резервную пластину из сфер в центрифуге надосадочной жидкости, резервную надосадочную жидкость в 170 раз больше G в течение 10 минут. Затем аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в нейральную прогениторную среднюю пластину в 24-луночном планшете, покрытом матригелем.

Как и раньше, меняйте среду в каждой пластине клеток через день, пока клетки не достигнут 60-80% слияния. Обычно через неделю. Как только клетки достигнут необходимого слияния, аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте в каждую из них по одному миллилитру среды нейральных стволовых клеток.

Затем диссоциируйте клетки с помощью скребка для клеток с последующим очень аккуратным пипетированием. Далее переложите ячейки из одной лунки из 24-луночной пластины в одну лунку из шести. Колодец пластина.

Добавьте в лунку еще один миллилитр среды и, повторив процедуру для всех лунок, поместите пластину с шестью лунками в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. Изменяйте полный объем среды через день до тех пор, пока клетки не достигнут 60% конфлюенции, после чего диссоциируйте и регулируйте клетки в соотношении один к трем, как только что было показано, чтобы заморозить часть недифференцированных нейральных стволовых клеток. Сначала приготовьте среду для замораживания стволовых клеток, добавив 20% оксид диметилсульфа или ДМСО в среду для нервных стволовых клеток, и положите на лед.

Затем диссоциируйте клетки в шестилуночной пластине. С помощью скребка для клеток и аккуратного пипетирования. Зарезервируйте аликвоту суспензии для подсчета клеток, а затем центрифугируйте клетки при 170-кратном G в течение 10 минут при комнатной температуре, пока клетки вращаются, подсчитайте клетки в аликвоте суспензии с помощью гемо, цитометра или автоматического клеточного счетчика и рассчитайте объем среды, необходимый для получения концентрации клеток от одного умноженного на 10 до шести клеток на миллилитр.

После того, как спин закончится, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в среде нейральных стволовых клеток в соотношении от 10 до шести клеток на миллилитр. Затем добавьте равный объем замораживающей среды пипеткой пять раз по 10 до пятой клетки в объеме одного миллилитра в криопробирку и заморозьте ячейки в контейнере для заморозки согласно инструкции производителя. Когда нейральные стволовые клетки в шестилуночной пластине достигнут 80% конфлюенции, отделите их с помощью резинового полицейского, а затем диссоциируйте с помощью аккуратного пипетирования.

Объедините клеточную суспензию в стерильную пробирку. Подсчитайте клетки с помощью гемо, цитометра или автоматического клеточного счетчика и отрегулируйте концентрацию клеточной суспензии до одного умноженного на 10 до пятой клетки на миллилитр с помощью нейроклеточной среды. Затем пипеткой нанесите один миллилитр клеточной суспензии на поли-D лизин и ламинатное покрытие в одну лунку 24-луночного планшета после повторения процедуры для желаемого количества лунок.

Инкубировать, как и раньше, в течение 24 часов. По истечении времени инкубации аспирируйте среду и замените ее нейронной дифференцировкой. Среду инкубируют в течение двух недель при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, меняя среду два раза в неделю через две недели.

Нейрональные стволовые клетки должны быть полностью дифференцированы, как показано здесь, и готовы к последующему применению, такому как иммунофлуоресцентное окрашивание. Первые два изображения показывают, что нейральные стволовые клетки экспрессируют гнездо в и SOX два. В то время как третье изображение демонстрирует, что ОКТ 4 не экспрессируется, DPI используется в качестве ядерного маркера, а масштабная линейка представляет 200 микрон.

После выполнения протокола дифференцировки, описанного в видео, дифференцированные нейроны экспрессируют нейронный маркер бета-три тубулин. Нейральные стволовые клетки человека также могут быть дифференцированы в глиальные клетки. При дифференцировке в астроциты клетки экспрессируют астроцитарный маркер GFAP.

Наконец, на этом изображении клетки дифференцированы в олигодендроциты и экспрессируют маркер олигодендроцитов. О, четыре. После освоения генерация индуцированных нервных стволовых клеток человека из периферической крови может быть осуществлена примерно за три недели.

При правильном выполнении, нейростволовые клетки могут быть дальнейшей дифференцировкой нейронов и неясным методом из-за длительных и сложных процессов генерации IPS и могут быть простым вариантом для создания специфических для пациента нейронных культур после его развития. Этот метод позволяет исследователям в области нейробиологии изучить моделирование отдельных клеточных культур для различных неврологических расстройств, которые могут лучше представлять генетические различия при конкретных расстройствах, особенно из отдельных образцов пациентов.