Автоматизированная Количественное кроветворной клетки - Стромальные межклеточного взаимодействия в гистологических Изображения Undecalcified Bone
8 апреля 2015 г.
Представлена стратегия количественного анализа гистологических данных в костном мозге. Конфокальная микроскопия флуоресцентно меченых клеток в срезах тканей приводит к получению двухмерных изображений, которые автоматически анализируются. Анализ колокализации различных типов клеток сравнивается с данными смоделированных изображений, что дает количественную информацию о клеточных взаимодействиях.
Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке ассоциаций между конкретными субпопуляциями клеток в костном мозге. Это достигается путем предварительного сбора гистологических криологических срезов из опухолей бедренных костей мышей. На втором этапе срезы окрашиваются для иммунофлуоресцентного анализа и получаются конфокальные изображения.
Затем изображения анализируются в цифровом виде. В конечном счете, положение различных типов клеток может быть смоделировано для расчета скорости и частоты контакта между конкретными иммунологическими клетками, представляющими интерес, и их микроокружением. Впервые идея этого метода возникла у нас, когда мы анализировали ниши микроокружения для долгоживущих плазматических клеток в костном мозге, и нам нужен был метод для однозначной количественной оценки клеточных ассоциаций в ткани костного мозга.
RA Maya продемонстрирует вам процедуру криоотсасывания бедренных костей у взрослой мыши. Во-первых, установите температуру образца и лезвия стандартного микротома, оснащенного лезвием из твердой ткани, на отрицательные 24 градуса Цельсия. После 15-минутной акклиматизации.
Закрепите блок образцов на металлическом держателе образцов с помощью криосреды для встраивания и при необходимости отрегулируйте ориентацию блока. Обрезайте образец до тех пор, пока кость не будет полностью раскрыта и не будет виден костный мозг. Затем отрегулируйте толщину профиля до семи микрон.
Далее зафиксируйте кусок скотча кавамото липкой стороной на верхней части образца блока с помощью дорогого кожаного деревянного шпателя, разрезающего образец и с помощью щипцов. Поверните ленту так, чтобы секция располагалась с верхней стороны. Затем перенесите ленту на предметное стекло микроскопа.
Закрепите скотч на предметном стекле скотчем, когда будет собран последний участок. Дайте образцам поехать не менее 30 минут и храните предметные стекла при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Две женщины визуализируют образцы, окрашивают размороженные криосрезы в соответствии с общими протоколами иммунофлюоресценции.
Обязательно включите ядерное окрашивание для визуализации целостности ткани. После того, как срезы будут окрашены, добавьте по одной капле напольного крепления к каждому образцу, а затем наклейте стекло номер один на лазерный сканирующий конфокальный микроскоп. Выберите объектив с 20-кратным увеличением и установите поле зрения 708 точек 15 на 708 точек 15 микрон.
Затем визуализируйте образцы по одному с разрешением 2048 на 2048 пикселей на изображение, чтобы результаты были сопоставимыми. Запись изображений в один канал для визуализации стромальных структур, один канал для ядер и дополнительные каналы для интересующих гемопоэтических клеток по мере необходимости. Записывайте изображения с помощью усреднения линий.
В идеале съемка отдельных смежных изображений, чтобы охватить весь бедренный отдел. Затем сохраните изображения в формате файла изображения для микроскопии. Затем экспортируйте по одному файлу JPEG на канал для каждой области изображения и используйте инструмент анализа изображений для выполнения сегментации изображения, количественной оценки колокализации и анализа окрестностей перед выполнением моделирования случайной ячейки.
Позиционирование на анализируемых изображениях костного мозга для каждого моделируемого изображения. Поместите следующие файлы в одну папку, в том числе CSV-файлы, предоставленные средством контакта с ячейками. Исходные файлы JPEG канала DPI и исходные файлы JPEG стромального канала для выполнения пакетного моделирования серии изображений из одного образца бедренной кости для переноса всех исходных файлов JPEG и соответствующих им отдельных файлов CSV в другую папку в настоящее время.
Когда все файлы собраны, запустите инструмент моделирования. Затем установите флажок автоматической загрузки данных изображения. При выборе этой опции CSV-файлы, соответствующие анализируемым изображениям, открываются автоматически.
Затем введите общий тег для CSV-файлов и количество наборов изображений, которые должны использоваться для моделирования в пакетном режиме. Затем загрузите файл J peg, сгенерированный из канала S-стромы, с именем, оканчивающимся на три, чтобы создать маску для канала DPI. Установите флажок «Применить маску» и установите пороговое значение для преобразования DPI-изображения в двоичную маску равным 10.
Отметьте окошки с восемью битами и расширением и установите степень расширения на пять пикселей. Затем поставьте галочку в поле эрозии ширины. Затем введите желаемое значение радиуса окрестности, используемого для анализа смоделированных изображений, и установите флажок Использовать OSU для использования алгоритма OSU для автоматического определения стромальных структур гемопоэтических клеток.
Моделируется в виде круглых форм. Измерьте распределение размеров клеток анализируемых типов клеток с помощью любого программного обеспечения для анализа изображений, которое включает соответствующие функции сегментации объектов, и определите сигма для всех типов гемопоэтических клеток на основе этих измерений. Можно определить предельный размер ячейки, то есть диаметр в пикселях, описывающий наименьший объект, который все еще распознается как полная ячейка инструментом анализа изображений.
Затем введите пороговое значение размера ячейки и сигму в пикселях для моделирования распределения размеров ячеек для красных, зеленых и синих ячеек. Затем на вкладке ячеек и маски установите флажок «Удалить», чтобы программа могла выбрать новое положение ячейки, если она перекрывается хотя бы с одним пикселем в запретной области маски. На вкладке исключения ячеек также установите флажок Избегать перекрытия ячеек.
Затем введите допустимое минимальное расстояние между центрами двух ячеек в пикселях. Если перекрытие определяется минимальным расстоянием от центра одной клетки до центра другой, установите максимальную площадь перекрытия равной 100%Затем установите инструмент моделирования на 1000 повторений. Затем установите флажок автоматического сохранения продаж, чтобы сохранить координаты смоделированных объектов для всех повторений каждого изображения партии в виде поврежденных файлов в текстовом формате.
Введите общий тег для сохраненных файлов. Наконец, нажмите на кнопку «Запустить моделирование» и определите среднюю частоту контакта и окрестностей наборов из 1000 смоделированных изображений, соответствующих каждому записанному изображению. Для этого деления среднее количество контактов и окрестностей подсчитывается по количеству записанных клеток на изображение, а частоты сравниваются с результатами автоматизированного анализа колокализации записанного изображения.
На этом рисунке представлен анализ локализации эозинофилов, плазматических клеток и В-клеток с микроокружением стромальных клеток с флуоресцентным химерным костным мозгом. Файлы CSV, созданные инструментами контакта и окрестности ячейки, содержат количество ячеек и общую площадь для каждой популяции клеток в пикселях, а также количество контактов или окрестностей. Перед выполнением моделирования случайного позиционирования клеток необходимо определить параметры, описывающие распределение размеров клеток как распределение по Гауссу, при этом были сохранены относительные значения сигма, измеренные для трех популяций клеток.
В то время как значения Sigma, определенные в пикселях, были установлены в соответствии с визуальным видом записанных ячеек для определения областей, где ячейки могут быть размещены, маска была сгенерирована из канала DAPI. Затем было определено значение 10 в качестве оптимального порога плотности для генерации двоичных изображений. Затем была проверена релевантность контактов плазматических клеток, эозинофилов или В-клеток со стромальными клетками, как и ожидалось.
Этот анализ показал значительно более высокую частоту контактов на записанных изображениях по сравнению с моделированием плазматических и В-клеток. В отличие от этого, не наблюдалось явной разницы при контакте эозинофиловых стромальных клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в любой области, требующей анализа сложной тканевой структуры костного мозга, такой как иммунология, гематология, патология или биология стволовых клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод для количественного анализа гистологических данных в костном мозге с использованием конфокальной микроскопии. Техника включает окрашивание секций ткани и цифровой анализ полученных изображений для оценки клеточных взаимодействий.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Гистология
Описание
- Понимание клеточных взаимодействий в костном мозге имеет решающее значение для исследований в области иммунологии.
- Гистологические криосекции используются для визуализации различных типов клеток.
- Конфокальная микроскопия позволяет получать детальные изображения окрашенных клеток.
- Количественный анализ этих взаимодействий может дать представление об иммунных реакциях.
Цель исследования
- Количественная оценка ассоциаций между конкретными клеточными подгруппами в костном мозге.
- Разработка метода для однозначного количественного определения клеточных ассоциаций.
- Моделирование положений клеток для расчета частот контактов между иммунологическими клетками.
Использованные методы
- Сбор гистологических криосекций из фемуров мышей.
- Окрашивание секций для иммунофлюоресцентного анализа.
- Получение конфокальных изображений для анализа.
- Цифровой анализ для определения клеточных взаимодействий и ассоциаций микроокружения.
Основные результаты
- Успешная количественная оценка клеточных ассоциаций в костном мозге.
- Определение частот контактов между конкретными иммунологическими клетками.
- Валидация метода сравнением с модельными изображениями.
- Представление о микроэнвиронментальных нишах для долгоживущих плазматических клеток.
Выводы
- Разработанный метод обеспечивает надежный подход для анализа клеточных взаимодействий.
- Количественные данные могут улучшить понимание динамики иммунных клеток.
- Эта техника может быть применена в различных исследованиях, связанных с костным мозгом и иммунными реакциями.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantifying cellular co-localization in bone marrow addresses a critical challenge in immunology and hematology research: distinguishing true biological associations from random cell positioning. This method provides reproducible, quantitative analysis of hematopoietic-stromal interactions, reducing rater-dependent bias and enhancing interrater reliability. The approach supports target validation and mechanistic de-risking in preclinical discovery by enabling data-driven assessment of cellular microenvironment dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying direct contacts between hematopoietic and stromal cells in complex tissues.
- Operational Value: Provides unbiased measurement of cellular associations, reducing variability from manual counting and improving assay reproducibility.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing preferential cell associations from random co-localization through statistical simulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized quantitative outputs (contact and vicinity frequencies) for hematopoietic cell subsets within the bone marrow microenvironment.
- Operational Value: Enables high-resolution image acquisition and digital analysis workflows compatible with confocal microscopy platforms.
- Scalability: Facilitates batch processing of multiple femoral sections via automated simulation tools for consistent data generation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase cellular interaction data to preclinical validation by characterizing microenvironmental niches for long-lived plasma cells and other immune subsets.
- Mechanistic De-risking: Uses simulation tools to test whether observed co-localization reflects biological preference versus random positioning, strengthening target confidence.
- Disease-Relevant System: Applicable to studies in immunology, hematology, pathology, and stem cell biology where bone marrow microenvironment analysis is critical.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research, supporting hypothesis testing and biological de-risking in hematopoietic and stromal cell interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying cellular associations and microenvironmental context in bone marrow tissues.
- Screening: Enables assay readiness through standardized image acquisition, segmentation, and colocalization quantification workflows.
- Analytics: Delivers quantitative readouts (contact rates, vicinity frequencies) and simulation-based statistical comparison to assess biological significance.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by characterizing cellular niches relevant to immune cell function and persistence.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for quantitative histological analysis across multiple bone marrow studies and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing objective, simulation-backed quantification of cellular interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automated image analysis and batch simulation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in cellular association data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on quantitatively validated microenvironmental interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, confocal microscopy, and digital image analysis for hematopoietic and stromal cell detection.
- Dependent on laser scanning confocal microscopy with appropriate objectives and line averaging for comparable image acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of image file formats, CSV data handling, and simulation tool parameters for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different cell types and tissue sections, including cell size cutoff and sigma determination for accurate simulation.
- Practical limitation: Simulation accuracy depends on precise measurement of cell size distribution and mask generation from DAPI channel for stromal structure definition.
