Автоматизированная Количественное кроветворной клетки - Стромальные межклеточного взаимодействия в гистологических Изображения Undecalcified Bone

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке ассоциаций между конкретными субпопуляциями клеток в костном мозге. Это достигается путем предварительного сбора гистологических криологических срезов из опухолей бедренных костей мышей. На втором этапе срезы окрашиваются для иммунофлуоресцентного анализа и получаются конфокальные изображения.

Затем изображения анализируются в цифровом виде. В конечном счете, положение различных типов клеток может быть смоделировано для расчета скорости и частоты контакта между конкретными иммунологическими клетками, представляющими интерес, и их микроокружением. Впервые идея этого метода возникла у нас, когда мы анализировали ниши микроокружения для долгоживущих плазматических клеток в костном мозге, и нам нужен был метод для однозначной количественной оценки клеточных ассоциаций в ткани костного мозга.

RA Maya продемонстрирует вам процедуру криоотсасывания бедренных костей у взрослой мыши. Во-первых, установите температуру образца и лезвия стандартного микротома, оснащенного лезвием из твердой ткани, на отрицательные 24 градуса Цельсия. После 15-минутной акклиматизации.

Закрепите блок образцов на металлическом держателе образцов с помощью криосреды для встраивания и при необходимости отрегулируйте ориентацию блока. Обрезайте образец до тех пор, пока кость не будет полностью раскрыта и не будет виден костный мозг. Затем отрегулируйте толщину профиля до семи микрон.

Далее зафиксируйте кусок скотча кавамото липкой стороной на верхней части образца блока с помощью дорогого кожаного деревянного шпателя, разрезающего образец и с помощью щипцов. Поверните ленту так, чтобы секция располагалась с верхней стороны. Затем перенесите ленту на предметное стекло микроскопа.

Закрепите скотч на предметном стекле скотчем, когда будет собран последний участок. Дайте образцам поехать не менее 30 минут и храните предметные стекла при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Две женщины визуализируют образцы, окрашивают размороженные криосрезы в соответствии с общими протоколами иммунофлюоресценции.

Обязательно включите ядерное окрашивание для визуализации целостности ткани. После того, как срезы будут окрашены, добавьте по одной капле напольного крепления к каждому образцу, а затем наклейте стекло номер один на лазерный сканирующий конфокальный микроскоп. Выберите объектив с 20-кратным увеличением и установите поле зрения 708 точек 15 на 708 точек 15 микрон.

Затем визуализируйте образцы по одному с разрешением 2048 на 2048 пикселей на изображение, чтобы результаты были сопоставимыми. Запись изображений в один канал для визуализации стромальных структур, один канал для ядер и дополнительные каналы для интересующих гемопоэтических клеток по мере необходимости. Записывайте изображения с помощью усреднения линий.

В идеале съемка отдельных смежных изображений, чтобы охватить весь бедренный отдел. Затем сохраните изображения в формате файла изображения для микроскопии. Затем экспортируйте по одному файлу JPEG на канал для каждой области изображения и используйте инструмент анализа изображений для выполнения сегментации изображения, количественной оценки колокализации и анализа окрестностей перед выполнением моделирования случайной ячейки.

Позиционирование на анализируемых изображениях костного мозга для каждого моделируемого изображения. Поместите следующие файлы в одну папку, в том числе CSV-файлы, предоставленные средством контакта с ячейками. Исходные файлы JPEG канала DPI и исходные файлы JPEG стромального канала для выполнения пакетного моделирования серии изображений из одного образца бедренной кости для переноса всех исходных файлов JPEG и соответствующих им отдельных файлов CSV в другую папку в настоящее время.

Когда все файлы собраны, запустите инструмент моделирования. Затем установите флажок автоматической загрузки данных изображения. При выборе этой опции CSV-файлы, соответствующие анализируемым изображениям, открываются автоматически.

Затем введите общий тег для CSV-файлов и количество наборов изображений, которые должны использоваться для моделирования в пакетном режиме. Затем загрузите файл J peg, сгенерированный из канала S-стромы, с именем, оканчивающимся на три, чтобы создать маску для канала DPI. Установите флажок «Применить маску» и установите пороговое значение для преобразования DPI-изображения в двоичную маску равным 10.

Отметьте окошки с восемью битами и расширением и установите степень расширения на пять пикселей. Затем поставьте галочку в поле эрозии ширины. Затем введите желаемое значение радиуса окрестности, используемого для анализа смоделированных изображений, и установите флажок Использовать OSU для использования алгоритма OSU для автоматического определения стромальных структур гемопоэтических клеток.

Моделируется в виде круглых форм. Измерьте распределение размеров клеток анализируемых типов клеток с помощью любого программного обеспечения для анализа изображений, которое включает соответствующие функции сегментации объектов, и определите сигма для всех типов гемопоэтических клеток на основе этих измерений. Можно определить предельный размер ячейки, то есть диаметр в пикселях, описывающий наименьший объект, который все еще распознается как полная ячейка инструментом анализа изображений.

Затем введите пороговое значение размера ячейки и сигму в пикселях для моделирования распределения размеров ячеек для красных, зеленых и синих ячеек. Затем на вкладке ячеек и маски установите флажок «Удалить», чтобы программа могла выбрать новое положение ячейки, если она перекрывается хотя бы с одним пикселем в запретной области маски. На вкладке исключения ячеек также установите флажок Избегать перекрытия ячеек.

Затем введите допустимое минимальное расстояние между центрами двух ячеек в пикселях. Если перекрытие определяется минимальным расстоянием от центра одной клетки до центра другой, установите максимальную площадь перекрытия равной 100%Затем установите инструмент моделирования на 1000 повторений. Затем установите флажок автоматического сохранения продаж, чтобы сохранить координаты смоделированных объектов для всех повторений каждого изображения партии в виде поврежденных файлов в текстовом формате.

Введите общий тег для сохраненных файлов. Наконец, нажмите на кнопку «Запустить моделирование» и определите среднюю частоту контакта и окрестностей наборов из 1000 смоделированных изображений, соответствующих каждому записанному изображению. Для этого деления среднее количество контактов и окрестностей подсчитывается по количеству записанных клеток на изображение, а частоты сравниваются с результатами автоматизированного анализа колокализации записанного изображения.

На этом рисунке представлен анализ локализации эозинофилов, плазматических клеток и В-клеток с микроокружением стромальных клеток с флуоресцентным химерным костным мозгом. Файлы CSV, созданные инструментами контакта и окрестности ячейки, содержат количество ячеек и общую площадь для каждой популяции клеток в пикселях, а также количество контактов или окрестностей. Перед выполнением моделирования случайного позиционирования клеток необходимо определить параметры, описывающие распределение размеров клеток как распределение по Гауссу, при этом были сохранены относительные значения сигма, измеренные для трех популяций клеток.

В то время как значения Sigma, определенные в пикселях, были установлены в соответствии с визуальным видом записанных ячеек для определения областей, где ячейки могут быть размещены, маска была сгенерирована из канала DAPI. Затем было определено значение 10 в качестве оптимального порога плотности для генерации двоичных изображений. Затем была проверена релевантность контактов плазматических клеток, эозинофилов или В-клеток со стромальными клетками, как и ожидалось.

Этот анализ показал значительно более высокую частоту контактов на записанных изображениях по сравнению с моделированием плазматических и В-клеток. В отличие от этого, не наблюдалось явной разницы при контакте эозинофиловых стромальных клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в любой области, требующей анализа сложной тканевой структуры костного мозга, такой как иммунология, гематология, патология или биология стволовых клеток.