Плазмиды, полученные ДНК замещения цепи Гейтс для реализации химической реакции сети

Общая цель этой процедуры заключается в получении ворот смещения цепи ДНК из бактериальных плазмид. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он использует бактериальную плазмиду в качестве высокочистого источника для создания надежных ДНК-гейтов. Демонстрировать эту процедуру будут мои коллеги Сэм Дип и я: начать массовое производство, а затем изолировать содержащие ДНК гейты, используя наборы для выделения ДНК, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, и в соответствии с инструкциями производителя, следуя эллуцианскому методу.

Измерьте концентрацию плазмидной ДНК с помощью стандартных методик. Затем расщепите ДНК, добавив четыре единицы фермента рестрикции PV U2 HF на каждый миллиграмм плазмиды. Далее добавьте в образец два эквивалентных объема ледяного абсолютного этанола.

Инкубируйте смесь при температуре минус 80 градусов Цельсия не менее одного часа, чтобы ДНК выпала в осадок. Затем гранулируйте осажденную ДНК путем центрифугирования образца при температуре от 10 000 до 14 000 раз G и нуле градусов Цельсия в течение 30 минут. Удалите SNAT и добавьте в образец 1000 микролитров 95%-ного этанола комнатной температуры.

Затем переверните образец от 10 до 15 раз, центрифугируйте образец при температуре от 10 000 до 14 000 раз G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Когда закончите, удалите надосадочную жидкость и высушите ДНК на воздухе на скамейке в течение 10-20 минут. При удалении надосадочной жидкости из осажденной ДНК будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулу, иначе выход будет значительно снижен.

После высыхания повторно суспендируйте гранулу ДНК в 200 микролитрах воды, свободной от нуклеаз, и перемешайте. Добавление более 200 микролитров воды, как правило, разбавляет образец для использования. В экспериментах по кинетике измеряйте ресуспендированную ДНК с помощью спектрофотометра в соответствии с инструкциями производителя.

Затем добавьте четыре единицы фермента M-B-B-S-R-D по одной на один микрограмм плазмиды и добавьте соответствующий ферментный буфер. Инкубируйте образец при температуре 65 градусов Цельсия в течение часа, чтобы переварить суставные ворота. Затем расщепляют вилочные затворы, добавляя восемь единиц фермента NT BST mb одну на один микрограмм плазмиды и соответствующий ферментный буфер.

Инкубируйте образец при температуре 55 градусов Цельсия в течение одного часа. Для подготовки флуоресцентных репортеров сначала выполните реакцию, приостановку и количественное определение образцов, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем смешайте 10 микролитров нижней нити репортеров с 13 микролитрами верхней нити гасителя в буфере трис ацетата ЭДТА с 12,5 миллимолярами магния.

Чтобы гарантировать, что вся флора, четыре меченые нити гасятся, следует добавить на 30% больше меченой нити. Далее аннулируйте репортерный комплекс С помощью термоамплификатора. Охладите образец с 95 градусов Цельсия до 20 градусов Цельсия со скоростью один градус Цельсия в минуту.

По завершении образец хранится при температуре четыре градуса Цельсия после калибровки. Начните измерения флуоресценции, установив регулятор температуры на 25 градусов Цельсия, пока температура стабилизируется. Настройте правильные параметры для измерений кинетики в программном обеспечении для сбора данных.

После открытия программного обеспечения для спектрального флуориметра установите ширину скольжения равной 2,73 нанометра для монохромного изображения возбуждения и излучения. Затем установите время интеграции на 10 секунд для каждой 62-й временной точки и установите общее время измерения на 24 часа. Наконец, установите длины волн возбуждения и излучения в соответствии с флорой, используемой в эксперименте.

Затем добавьте 410,2 микролитра воды без нуклеазы и 52,8 микролитра 10 экстра ацетатного буфера ЭДТА, содержащего 125 миллимоляров магния, в синтетический кварцевый элемент. Также добавьте два микролитра 300 миллимолярных поли Т нитей, а затем сделайте вихревой слой синтетического кварца в течение 10-15 секунд. Далее на девять микролитров репортерных нитей на 10 микромолярах и по шесть микролитров каждой вспомогательной нити на 10 микромолярах.

Затем по 45 микролитров как стыка, так и вилки затворов на один микромоляр и аккуратно перемешайте раствор, пипетируя его вверх и вниз не менее 20 раз. Наконец, при девяти микролитрах 10% натрия до протокового сульфата для достижения конечной концентрации 0,15% SDS осторожно перемешайте реакцию пипетированием вверх и вниз не менее 20 раз, немедленно поместите синтетические квартовые ячейки в камеру спектрального флютера и начните измерение кинетики. После пяти минут измерения добавьте три микролитра входных прядей.

Добавьте 10 микромоляров в синтетическую кварту. Пока программа сбора данных приостановлена, аккуратно перемешайте реакцию, пипетируя ее вверх и вниз не менее 20 раз, а затем закройте световую крышку и продолжайте записывать кинетику реакции, пока она не достигнет устойчивости. Данные о кинетике состояния плазменных вентилей и синтезированных вентилей показаны в экспериментах.

Концентрация сигнальной цепи А фиксирована, в то время как величина каталитического сигнала В варьируется. Сигнал C используется для считывания хода реакции без прерывания. Круговорот каталитического цикла определяется как количество сигнала С, производимого для каждого катализатора В в данный момент времени.

Для идеальной каталитической системы это число оборота должно линейно увеличиваться со временем и не зависеть от количества катализатора до тех пор, пока подложка не является ограничивающей. При этом было замечено, что синтезированная система отклоняется от идеального линейного увеличения оборота гораздо раньше, чем это происходит в плазменной системе, что указывает на секвестрацию катализатора в результате нежелательной побочной реакции. Здесь сравнивается утечка в контуре как полученного из плазмы, так и синтезированного затвора, и видно, что коэффициент сигнала утечки при использовании плазменных вентилей примерно на 8% меньше, чем при использовании синтезированных вентилей после 10 часов реакции.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как создать надежные ДНК-гейты из бактериальной плазмиды и проверить ворота с помощью измерений кинетики флуоресценции.