Трехмерных изображений и анализ митохондрии внутри человека Intraepidermal нервных волокон

Общая цель этого метода визуализации и анализа состоит в том, чтобы изолировать конкретную информацию от сложного сигнала. В частности, этот протокол описывает, как визуализировать и количественно определить нервно-специфические митохондрии с другими митохондриями в эпидермисе. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области неврологии, например, как митохондрии во внутриэпидермальных нервных волокнах здоровых людей соотносятся с нерв-специфическими митохондриями пациентов с неврологическими осложнениями.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы берем сложный сигнал и извлекаем из него конкретную информацию. Этот протокол помогает нам изолировать определенный сигнал, такой как сигнал в этих трубочках, от сигналов вокруг них. Подготовьтесь к флуоресцентному иммуногистохимическому окрашиванию биопсий кожи, предварительно промаркировав 96-луночный планшет в соответствии с этой схемой.

Затем пипеткой впрыскивают 150 микролитров стокового раствора усилителя сигнала для уменьшения неспецифического связывания вторичных антител в каждую лунку верхнего ряда. Приготовьте лунки для промывки, добавив 150 микролитров 1x фосфатного буферного раствора в каждую лунку во втором и третьем рядах 96-луночного планшета. Затем добавьте 150 микролитров 5%-ного блокирующего раствора БСА в лунки четвертого ряда.

Разведите первичные антитела PGP9,5 и PDH в 1 500 мк 1% раствора для промывки БСА и добавьте по 150 мк в каждую лунку в пятом ряду. Используйте контур модификации для переноса секций в раствор усилителя сигнала в первом ряду. Как только срезы окажутся в первичном растворе антитела в пятом ряду, плотно оберните планшет лабораторной пленкой, чтобы предотвратить испарение, а затем перемешайте образцы на плоской коромысле при комнатной температуре в течение одного часа.

Инкубировать с укачиванием на ночь при четырех градусах Цельсия. Начните второй день процедуры с пипетирования 150 микролитров 1% промывочного раствора BSA в лунки в шестом, седьмом и восьмом рядах 96-луночного планшета. Добавьте флуорконъюгированные вторичные антитела к 1500 микролитрам 1% БСА.

Затем пипеткой нанесите по 150 микролитров раствора вторичного антитела в каждую лунку девятого ряда. Промойте секции, пройдя через шестую, седьмую и восьмую лунки. Как только срезы окажутся во вторичном растворе антитела в девятом ряду, оберните пластину парапленкой и накройте алюминиевой фольгой для защиты сигналов флуоресценции.

Инкубируйте с укачиванием, как и раньше. На третий день пипетка 150 микролитров стерильной фильтрованной 1x PBS в ряды 10, 11 и 12. Переложите образцы в ряд 10, затем накройте пластину алюминиевой фольгой.

Полоскать в течение часа при комнатной температуре с покачиванием. Далее подготовьте предметное стекло микроскопа для монтажа срезов, нанеся на предметное стекло 50 микролитров отфильтрованного 1x PBS. После завершения промывки перенесите секцию из ряда 12 на предметное стекло, затем добавьте одну-две капли монтажного реагента, содержащего DAPI, непосредственно на верхнюю часть секции.

Аккуратно поместите покровное стекло микроскопа размером 50 на 24 миллиметра 1,5 мм на срез. Поместите предметные стекла в темноту на ночь при комнатной температуре, чтобы отверждение монтажного носителя перед хранением или визуализацией слайдов. Выберите 40-кратный масляный иммерсионный объектив на инвертированном лазерном сканирующем конфокальном микроскопе.

Выберите подходящие лазеры и детекторы для визуализации ядер, нервных волокон и митохондрий. Введите в программное обеспечение микроскопа следующие параметры сканирования: 12-битное разрешение интенсивности, скорость сканирования 500 Гц с двухкадровым усреднением и зум 2,2. Настройте программное обеспечение микроскопа для оптимального бокового разрешения, выбрав разрешение сканирования 1024 x 1024.

Оптимизируйте осевое разрешение и оптическое сечение, выбрав конфокальную апертуру одного воздушного блока с шагом Z 210 нанометров. Сканируйте каждый сигнал отдельно и регулируйте напряжение детектора и смещение, чтобы удалить все избыточные и недостаточно насыщенные пиксели. Активируйте сканирование нервного сигнала в реальном времени и отрегулируйте Z-фокус, чтобы найти и установить верхнюю и нижнюю фокальные плоскости в программном обеспечении микроскопа, которые охватывают нервный сигнал в области ткани.

Сканирование финальной версии серии Z с помощью последовательного сканирования для устранения перекрестных помех флуоресцентного сигнала. Изолируйте эпидермис от рогового слоя и дермы, нарисовав область вокруг эпидермиса с помощью инструмента выделения на дубликате исходного изображения. Затем обрежьте изображение до выделения.

Вычисление функций рассеяния точки для конфокальных сигналов зеленого и красного флуоресцентных сигналов с помощью функции расчета спреда. Затем установите параметры для среднего показателя преломления для масла на 1,515 и числовую апертуру для 40-кратного масляного объектива на 1,25. Установите отверстие детектора на одну воздушную единицу и выберите длину волны лазерного возбуждения.

Используйте итеративное восстановление, установленное на 100% достоверность, ограничение итерации в 10 циклов, а также зеленый и красный PSF для деконвуляции зеленого и красного сигналов флуоресценции. Используйте инструмент Создать поверхность, чтобы создать поверхность вокруг деконволюционных нервных сигналов, выбрав сглаженный признак, абсолютную интенсивность порогового значения, нижний порог 3 000 и верхний порог 65 535. Держите поверхности выше 10 вокселей.

Удалите ненервные поверхности с помощью вкладки «Правка» в нервной поверхности для выбора отдельных ненервных поверхностей или, удерживая нажатой клавишу Control, чтобы выбрать несколько ненервных поверхностей. Удалите выделенные ненервные поверхности, нажав кнопку Delete. Используйте вкладку редактирования в нервной поверхности и нажмите кнопку маски все в свойствах маски.

В новом окне выберите деконволюцию митохондрий пятого канала под выделенным каналом, а затем проверьте дубликат канала перед наложением маски. Нажмите радиокнопку для постоянного внутри/снаружи и проверьте установленное количество вокселей снаружи поверхности на 0,0 и нажмите кнопку OK. Наконец, создайте поверхности, специфичные для митохондрий, с помощью инструмента «Создать поверхность», чтобы создать поверхность вокруг замаскированных деконволюционных митохондриальных сигналов, выбрав «Снять флажок» и используя фоновое вычитание для порогового значения.

Установите диаметр самой большой сферы равным 1,50 микрометра, нижнего порога — 2 000, а верхнего порога — максимальному 65 535. Обязательно держите поверхности выше 1,0 вокселей. Это репрезентативное изображение с помощью конфокальной 3D-микроскопии иллюстрирует специфичный для нервов зеленый флуоресцентный сигнал.

3D-поверхность, показанная голубым цветом, создается для нервного сигнала. Затем нервно-специфический митохондриальный сигнал изолируется от остальных эпидермальных митохондриальных сигналов с использованием нервной поверхности в качестве маскирующего инструмента. Полученный нервоспецифичный митохондриальный красный флуоресцентный сигнал используется для создания поверхностей, показанных пурпурным цветом вокруг митохондрий внутри нервной поверхности, которая показана голубым цветом.

Это позволяет детально рассмотреть митохондрии в нервных волокнах. Здесь данные о митохондриальной поверхности представлены в виде гистограммы частоты, чтобы визуализировать процент митохондрий, присутствующих в каждом из различных изгибов в соответствии с их объемом. Во время этой процедуры важно ухаживать за тканью во время процесса окрашивания, чтобы убедиться, что ткань полностью погружена в растворы для обеспечения равномерного и равномерного окрашивания на всех срезах.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как визуализировать и количественно оценить митохондрии в интраэпидермальных нервных волокнах человека. Наш подробный протокол был разработан для того, чтобы научить других исследователей окрашивать, визуализировать, обрабатывать и анализировать биопсию кожи человека с целью понимания механизмов, лежащих в основе патогенеза митохондриальных неврологических заболеваний, таких как невропатия.