Трехмерных изображений и анализ митохондрии внутри человека Intraepidermal нервных волокон

Общая цель данного метода визуализации и анализа заключается в выделении специфической информации из сложного сигнала. В частности, в данном протоколе описывается способ визуализации и количественной оценки специфических митохондрий нервов на фоне других митохондрий в эпидермисе. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области неврологии, например, как митохондрии в интраэпидермальных нервных волокнах здоровых людей соотносятся со специфическими митохондриями нервов у пациентов с неврологическими осложнениями.

Основным преимуществом данного метода является возможность извлечения специфической информации из сложного сигнала. Этот протокол позволяет изолировать конкретный сигнал, например, сигнал в этих соломинках, от окружающих его сигналов. Подготовьтесь к проведению иммунофлуоресцентного окрашивания биоптатов кожи, сначала промаркировав 96-луночный планшет в соответствии с данной схемой.

Затем пипеткой внесите 150 µL стокового раствора усилителя сигнала в каждую лунку верхнего ряда, чтобы снизить неспецифическое связывание вторичных антител. Подготовьте промывочные лунки, добавив по 150 µL 1x фосфатно-солевого буфера в каждую лунку второго и третьего рядов 96-луночного планшета. Затем добавьте по 150 µL 5% БСА-блокирующего раствора в лунки четвертого ряда.

Разведите первичные антитела PGP9.5 и PDH в 1 500 µL промывочного раствора 1% BSA и добавьте по 150 µL в каждую лунку пятого ряда. Используйте инокуляционную петлю, чтобы перенести срезы в раствор усилителя сигнала в первом ряду. После помещения срезов в раствор первичных антител в пятом ряду плотно оберните планшет лабораторной пленкой для предотвращения испарения, затем перемешивайте образцы на плоском рокере при комнатной температуре в течение одного часа.

Инкубируйте в течение ночи при температуре 4 °C на встряхивателе. На второй день процедуры внесите по 150 µL промывочного раствора 1% BSA в лунки шестого, седьмого и восьмого рядов 96-луночного планшета. Добавьте вторичные антитела, конъюгированные с флуорофором, к 1 500 µL 1% BSA.

Затем пипеткой внесите 150 µL раствора вторичных антител в каждую лунку девятого ряда. Промойте срезы, переместив их через лунки шесть, семь и восемь. Когда срезы окажутся в растворе вторичных антител в девятом ряду, оберните планшет парафильмом и накройте алюминиевой фольгой для защиты флуоресцентных сигналов.

Инкубируйте при перемешивании, как и ранее. На третий день внесите по 150 µL стерильного фильтрованного 1x PBS в ряды 10, 11 и 12. Перенесите образцы в ряд 10, затем накройте планшет алюминиевой фольгой.

Промывайте в течение одного часа при комнатной температуре на качалке. Затем подготовьте предметное стекло для заключения срезов, пипеткой нанеся на стекло 50 µL фильтрованного 1x PBS. После завершения промывки перенесите срез из ряда 12 на стекло, затем добавьте одну или две капли заключающего реагента, содержащего DAPI, непосредственно на срез.

Осторожно накройте срез покровным стеклом для микроскопа размером 50 мм на 24 мм и толщиной 1,5 мкм. Оставьте стекла в темноте при комнатной температуре на ночь для полимеризации фиксирующей среды перед хранением или визуализацией. Выберите объектив с масляным погружением 40X на инвертированном лазерном сканирующем конфокальном микроскопе.

Выберите подходящие лазеры и детекторы для визуализации ядер, нервных волокон и митохондрий. Введите в программном обеспечении микроскопа следующие параметры сканирования: 12-битное разрешение интенсивности, скорость сканирования 500 Гц с усреднением по двум кадрам и зум 2,2. Для оптимизации латерального разрешения установите в программном обеспечении микроскопа разрешение сканирования 1024 на 1024.

Оптимизируйте осевое разрешение и оптический срез, выбрав конфокальную апертуру в одну воздушную единицу (air unit) с шагом по Z 210 nanometers. Сканируйте каждый сигнал по отдельности, настраивая напряжение детектора и смещение (offset) для устранения перенасыщенных и недонасыщенных пикселей. Активируйте режим сканирования в реальном времени для сигнала нерва и с помощью управления Z-фокусировкой найдите и установите в программном обеспечении микроскопа верхнюю и нижнюю фокальные плоскости, охватывающие сигнал нерва в срезе ткани.

Выполните сканирование финальной Z-серии с последовательным сканированием, чтобы исключить перекрестные помехи флуоресцентного сигнала. Изолируйте эпидермис от рогового слоя и дермы, обведя область эпидермиса с помощью инструмента выделения на дубликате исходного изображения. Затем обрежьте изображение по границам выделения.

Рассчитайте функции рассеяния точки для сигналов конфокальной флуоресценции зеленого и красного цветов с помощью функции расчета функции рассеяния (calculate spread function). Затем установите параметры показателя преломления среды для иммерсионного масла на 1,515 и числовую апертуру для 40-кратного масляного объектива на 1,25. Установите отверстие диафрагмы детектора на одну воздушную единицу и выберите длину волны лазерного возбуждения.

Используйте итерационную реставрацию с установленным уровнем доверия 100%, лимитом итераций в 10 циклов, а также зеленые и красные PSF для деконволюции сигналов зелечной и красной флуоресценции. Используйте инструмент создания поверхности (create surface), чтобы создать поверхность вокруг деконволюированных сигналов нервов, выбрав опцию «отключить сглаживание признаков» (uncheck smooth feature), «абсолютную интенсивность» (absolute intensity) для пороговой обработки, нижний порог 3 000 и верхний порог 65 535. Сохраняйте поверхности объемом более 10 вокселей.

Удалите поверхности, не относящиеся к нервам, используя вкладку редактирования в разделе «поверхность нерва» (nerve surface) для выбора отдельных поверхностей или удерживая клавишу Control для выбора нескольких поверхностей. Удалите выбранные поверхности, нажав кнопку Delete. Перейдите на вкладку редактирования в разделе «поверхность нерва» и нажмите кнопку «замаскировать все» (mask all) в свойствах маски.

В новом окне в разделе выбора каналов выберите «channel five mitochondria deconvolved», затем перед применением маски установите флажок «duplicate channel». Выберите переключатель «constant inside/outside», установите значение «set voxels outside surface» на 0.0 и нажмите кнопку «OK». Наконец, с помощью инструмента «create surface» создайте специфические поверхности митохондрий вокруг маскированных деконволюционных сигналов митохондрий, выбрав параметр «uncheck smooth feature» и используя вычитание фона для определения порога.

Установите диаметр наибольшей сферы на 1.50 micrometers, нижний порог на 2 000, а верхний порог на максимальное значение 65 535. Убедитесь, что поверхности превышают 1.0 voxels. Это репрезентативное изображение 3D-конфокальной микроскопии иллюстрирует нерв-специфичный сигнал зеленой флуоресценции.

Для нервного сигнала создается 3D-поверхность, отображаемая голубым цветом. Затем с помощью этой поверхности в качестве маски специфический сигнал митохондрий нерва отделяется от остальных сигналов митохондрий эпидермиса. Полученный сигнал красной флуоресценции митохондрий, специфичный для нерва, используется для создания поверхностей, отображаемых пурпурным цветом, вокруг митохондрий внутри поверхности нерва, которая показана голубым цветом.

Это позволяет детально рассмотреть митохондрии в нервных волокнах. Здесь данные о поверхности митохондрий представлены в виде гистограммы распределения размеров для визуализации процентного содержания митохондрий каждого из различных диапазонов в зависимости от их объема. При выполнении данной процедуры важно бережно обращаться с тканью во время окрашивания, чтобы она была полностью погружена в растворы для обеспечения равномерного и однородного окрашивания всех срезов.

После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как визуализировать и количественно оценивать митохондрии в интраэпидермальных нервных волокнах человека. Наш подробный протокол разработан для того, чтобы обучить других исследователей методам окрашивания, получения изображений, обработки и анализа биоптатов кожи человека с целью изучения механизмов, лежащих в основе патогенеза неврологических заболеваний, связанных с митохондриальными нарушениями, таких как нейропатия.