Рецептор Авторадиография Протокол о локализованного визуализации ангиотензина II Рецепторы

Общая цель этой процедуры заключается в анатомической локализации и количественном определении экспрессии рецептора ангиотензина II в срезах мозга с использованием авторадиографии рецепторов и гистологической идентификации структур мозга. Этот метод определяет области мозга, в которых ангиотензин II влияет на поведение, когнитивные функции и сердечно-сосудистую систему, обеспечивая понимание новых методов лечения нейродегенеративных и сердечно-сосудистых заболеваний. Основные преимущества этой методики заключаются в том, что она является количественной, качественной и позволяет идентифицировать функциональные рецепторы для ангиотензина II с большей специфичностью, чем другие методы.

Этот метод также может охарактеризовать функциональность других систем гормональных рецепторов по всему организму, таких как рецепторы, связанные со злоупотреблением наркотиками. Сразу после сбора урожая поместите ткани мозга в формы для мозга, которые имитируют внутреннюю часть черепа, и заверните формы в алюминиевую фольгу для хранения при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Через 30 минут переложите салфетки в герметичный пакет для хранения в морозильной камере и храните пакет при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Перед разделением аккуратно извлеките мозг из мозговой формы. Чтобы сделать срез ткани мозга, перенесите интересующий образец в набор криостатов при температуре от минус 10 до минус 18 градусов по Цельсию. Когда ткань уравновесится до новой температуры, используйте среду на основе гликоля и смолы для вертикального встраивания небольшой части образца в тканевое крепление, чтобы обеспечить разрез корональной плоскости.

Загрузите ткань на микротом и плотно затяните крепление на месте, затем начните резать мозг нужной толщины, затем установите срезы на предметные стекла микроскопа в вертикальной ориентации, чтобы нанести большую площадь поверхности ткани на предметное стекло. Собирайте разделы в последовательные наборы по пять. Когда все секции будут собраны, дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе в течение одного часа.

Затем поместите образцы в пластиковую задвижную коробку в самозакрывающийся пакет для заморозки для хранения при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Чтобы промаркировать образцы радиомаркировкой, снимите первый и второй слайды из каждого набора из пяти слайдов и установите их в коммерчески доступные или напечатанные на 3D-принтере ручки слайдов. Слайды в виде тире 1 предназначены для неспецифической группы лечения, а два слайда - для всей группы лечения.

Переверните предметные стекла в 35-40 миллилитров AM5 комнатной температуры плюс их соответствующие ингибиторы в соответствующих банках для предварительной инкубации Coplin. Запуск нескольких наборов слайдов может быть ошеломляющим. Поэтому крайне важно помещать предметные стекла в банки для предварительной инкубации с интервалом в четыре минуты, чтобы убедиться, что на этапе сушки не будет перекрытия.

Через 30 минут перенесите предметные стекла в инкубационные слайдеры, содержащие 10 миллилитров AM5 с соответствующей концентрацией I125 SI Angiotensin II и соответствующими ингибиторами группы лечения в течение 60-90 минут при комнатной температуре. Определение точной концентрации 125I SI Ang II имеет решающее значение для сравнения рецепторов ангиотензина II от одного дня к другому. В конце инкубации верните предметные стекла на ручки слайдов, заблокируйте стекла и осторожно покрутите их в течение одной-двух секунд в двух отдельных емкостях по 400 миллилитров дистиллированной воды.

После второй промывки водой промойте предметные стекла четырьмя последовательными одноминутными промывками в 30-40 миллилитрах AM5. После четвертой промывки аккуратно взболтайте срезы в течение одной-двух секунд в четырех сменах ледяной дистиллированной воды. Затем с помощью четырех фенов, установленных под разными углами, просушите горки прохладным воздухом в течение четырех минут.

Когда все разделы высохнут, переложите слайды на бумажное полотенце. Затем используйте двусторонний скотч для крепления предметных стекол тканевой стороной вверх на листе картона для рентгеновской пленки в нужном месте, включая по крайней мере одно стандартное предметное стекло йода-125 на группу. Чтобы на пленку экспонировать срезы, в темной комнате поместите картонные предметные стекла внутрь ремешка обратной рентгеновской кассеты и выключите свет.

Включите безопасный свет и осторожно откройте коробку с рентгеновской пленкой. Поместите одну пленку блестящей стороной вверх с зазубренным краем в правом нижнем углу поверх слайдов в кассете. Затем осторожно закройте кассету со скрученными стопорными планками, чтобы запечатать свет, и храните кассету при температуре минус 20 градусов по Цельсию.

По истечении соответствующего периода выдержки переложите пленку в раствор проявителя на две минуты, затем 30 секунд в стоп-ванну, дважды дистиллированную воду с уксусной кислотой, а затем на пять минут в раствор фиксатора. Постирайте пленку в поддоне с проточной водой в течение 20 минут. Переложите его в поверхностный слой примерно на 10 секунд и повесьте пленку сушиться.

Для гистологического анализа срезов мозговой ткани разморозьте три среза приборной панели в штативе для предметных стекол. Затем промойте срезы в деионизированной воде в течение одной минуты, затем 10-минутную инкубацию в растворе морилки тионина и три погружения в одну емкость с деионизированной водой. Погрузите предметные стекла для дополнительной 30-секундной промывки деионизированной водой.

Затем промойте предметные стекла последовательными промывками этанолом, как указано. После последней промывки 100% этанолом промойте предметные стекла в двух емкостях с ксилолом в течение трех и пяти минут подряд. В конце второй промывки ксилолом накройте верхний край одного предметного стекла смоляной основой, неорганическим растворителем для монтажа.

Крепление чехла размером 24 на 60 миллиметров скользит по слайдам и дает слайдам высохнуть в течение 48 часов. Затем отсканируйте слайды и пленку в компьютере с разрешением 2400 DPI в оттенках серого. Для анализа пленки методом денситометрии, после сканирования, опытным путем очерчивают интересующие участки на каждой пленке.

Это псевдоцветное изображение, генерируемое после открытия отсканированной пленки в программе анализа изображений. Включите в измерения плотность, область сканирования и общую целевую площадь. Настройте полосы области сканирования таким образом, чтобы каждая область интереса попадала между параметрами выделения.

Затем экспортируйте данные в электронную таблицу, чтобы определить конкретную привязку, присутствующую для каждого образца. Единицы калибровочного стандарта для количественного анализа определяются на основе даты проведения анализа. После сканирования пленок калибровочные значения используются для построения кривой, основанной на различных концентрациях стандартов йода-125 для этой конкретной пленки.

Для обеспечения точности калибровка и стандартные значения записываются в трех экземплярах. Различия между неспецифическим связыванием и общими группами, а также тканевыми метками устанавливаются путем отнесения каждого набора данных к соответствующим подгруппам. Более высокое пороговое значение следует установить, изменив параметры с красного на черный, в то время как нижнее пороговое значение должно быть установлено близко к нулю, чтобы обеспечить более точное измерение всей сканируемой области интереса.

Например, здесь окончательные измеренные участки паравентрикулярного ядра гипоталамуса в общей и неспецифической группах связывания сравниваются с окрашенным тионином срезом для анатомического подтверждения. Неспецифическое связывание – это количество радиолиганда, связанного с неангиотензиновыми рецепторами в присутствии насыщающей концентрации нерадиоактивного лиганда рецептора ангиотензина I, тогда как полное связывание – это количество радиолиганда, связанного в отсутствие нерадиоактивного лиганда рецептора ангиотензина I. Затем неспецифические значения связывания могут быть вычтены из общих значений связывания для получения специфических значений связывания для рецепторов ангиотензина I.

После освоения стадия рецепторной авторадиографии может быть завершена примерно за четыре часа, в то время как стадия проявки пленки занимает около 30 минут на пленку. При выполнении этой процедуры важно следить за временем, чтобы убедиться, что все предметные стекла инкубированы, промыты и высушены в течение одного и того же времени. После этой процедуры могут быть проведены дополнительные исследования морфологии мозга для оценки изменений в размерах областей, демонстрирующих экспрессию рецептора ангиотензина II.

Этот метод проложил путь для исследователей, изучающих фармакологию рецепторов, чтобы определить, как различные области мозга подвергаются воздействию различных нейрогормонов, нейротрансмиттеров и лекарств. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как успешно провести рецепторный ауторадиографический анализ, гистологически окрашенные препараты, а также оценить ауторадиограммы для локализации рецепторов в конкретных областях мозга. Помните, что работа с радиоактивностью может быть опасной, и во избежание радиоактивного загрязнения всегда следует принимать меры предосторожности, такие как надлежащая защита, изоляция, мониторинг облучения и утилизация.