Кожный Хирургическая Денервация: Метод для тестирования Требование нервах у мышей моделях болезни кожи

Общая цель этой процедуры заключается в изучении влияния нервов на нормальную и патологическую кожу. Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы нормальной биологии кожи, например, влияют ли кожные нервы на гомеостаз и заболевание. Основное преимущество этой методики заключается в том, что можно сравнить неповрежденные и денервированные образцы кожи одного и того же животного.

Визуальная демонстрация этой техники имеет решающее значение, так как нервы может быть трудно распознать и удалить с минимальным повреждением окружающих тканей. Во-первых, обезболите мышь и убедитесь, что она достигла нужной плоскости седации, с помощью зажима пальца ноги. Кроме того, убедитесь, что у мыши нормальное дыхание и сердцебиение.

Теперь положите животное на грелку в асептической хирургической зоне. С помощью электрической машинки для стрижки осторожно удалите волосы с тыльной стороны, где будет проводиться биопсия. Затем протрите выбритый участок с помощью Бетадина и спиртовых салфеток.

Убедитесь, что все обрезки волос удалены с участка. Теперь наметьте место биопсии с помощью черного маркера. Для получения продольных срезов волосяных фолликулов более длинный край биопсии должен проходить в переднем и заднем направлении, парасетидально к дорсальной средней линии.

С помощью скальпеля сделайте иссечение на всю толщину, не повреждая подлежащую мышечную фасцию. Кровотечение, как правило, минимальное. Образец биопсии должен включать эпидермис, дерму, подкожный жир и панникулюс карноз.

Разровняйте иссеченный образец кожи на сухом бумажном полотенце дермой вниз. Отрежьте лишнее бумажное полотенце и храните образец на холодном TBS до часа, если необходимо собрать другие образцы. Возвращаясь к мыши, зашить место биопсии с помощью 60 нейлоновых швов на расстоянии примерно трех миллиметров друг от друга.

Затем наблюдайте за мышью в клетке для восстановления, пока она не придет в сознание. Используйте анальгетики в соответствии с назначенными учреждениями по уходу за животными и следуйте их рекомендациям, если мышь выглядит подавленной. В течение 7-10 дней после операции снимите швы.

Приступайте к обработке биопсии для гистологии или окрашивания по всему монту. Обезболите животное, сбрейте всю спинную кожу и очистите область аналогично процедуре биопсии. Теперь сделайте разрез с помощью стерильного скальпеля вдоль спинной средней линии от основания шеи примерно на полсантиметра над хвостом.

С помощью стерильных тупых щипцов аккуратно отведите кожу с левой стороны от бока, чтобы визуализировать подлежащие ткани от лопаточных жировых пакетов возле шеи до чуть выше задней конечности. Теперь определите дорсальный кожный нерв под рассекающим световым микроскопом. Они выглядят как белые нити, которые проходят каудально через полупрозрачную фасцию стенки ствола, прежде чем сделать резкие изгибы и войти в рыхлую соединительную ткань под кожей.

Далее с помощью ультратонких щипцов удалите нервы исключительно с левой стороны животного, расположенные на анатомических участках от Т3 до Т12, выщипывая их от мест, где их сегменты изгибаются у стенки туловища, к местам их входа в кожу. Расположите щипцы вертикально и захватите нервы примерно на полсантиметра ниже мест их изгиба. После захвата потяните вверх, чтобы нервы растянулись, и отделитесь от окружающих тканей, чтобы удалить их.

Избегайте повреждения соседних кровеносных сосудов. Обязательно поддерживайте влажность тканей на протяжении всей процедуры, периодически нанося капли 0,9%-ного негазированного раствора. Продолжайте удалять все нервы, идущие от стенки туловища к коже, но не разрушайте нервы в плотной фасции стенки туловища.

Затем удалите все нервы с открытого кожного лоскута. Эти волокна составляют дистальные ветви тыльного кожного нерва и выглядят как белые ветвящиеся нити, спорадически расположенные в соединительной ткани на дермальной стороне кожного лоскута. Чтобы удалить эти тонкие ветви, расположите щипцы примерно параллельно дермальной поверхности, захватите нерв и вытяните вверх.

Удалите таким образом все видимые нервы. Не прокалывайте кровеносные сосуды и кожу. На этом этапе важно избежать разрыва соседних кровеносных сосудов.

Если вы обнаружили нерв с прилегающим кровеносным сосудом, проследите за ним в конечном итоге до области, где нет соседнего сосуда, и удалите его путем выщипывания. Теперь ослабьте кожу с правой стороны дорсального разреза по средней линии, но не удаляйте нервы. Это будет служить контралатеральным фиктивным оперативным контролем.

швы на животное и наблюдайте после операции, как и раньше. Позже, чтобы подтвердить стабильную потерю нервов, через несколько недель после операции, аккуратно проколите денервированный участок с помощью стерильной иглы для подкожных инъекций. Обратите внимание, реагирует ли животное, как правило, вздрагиванием или поворотом головы.

Если участок кожи был стабильно денервирован, животное будет проявлять незначительную реакцию или вообще не будет проявлять. Биопсия кожи из области отсутствия ответа и контралатеральной фиктивной стороны для получения совместимых экспериментальных и контрольных образцов. Из биопсии важно взять несколько гистологических срезов, чтобы выявить потенциальные различия в распространенности или морфологии контактного купола между фиктивными и денервированными образцами.

Мышиный штамм glebe one cree ERT2 позволяет нацеливаться на вызванную тамоксифеном генетическую рекомбинацию на участки кожи, которые демонстрируют высокую активность пути ежа, такие как эпителий купола прикосновения. Этих мышей скрещивали, чтобы побудить мышей-репортеров аболакси визуализировать эпителий купола прикосновения. Узлы имеют решающее значение для поддержания как нормальных контактных куполов, так и связанных с ними ячеек Меркеля.

Это демонстрируется экспериментально постепенной потерей нормальной морфологии купола прикосновения, а также потерей восьми отложенных клеток кератина после денервации. Нервы также имеют решающее значение для передачи сигналов ежа в сенсорном куполе, что контролируется выражениями Glebe one cree ERE2 и коллективным окрашиванием как с фиктивной, так и с денервированной кожи. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как хирургически абляировать дорсальные кожные нервы, чтобы проверить, участвуют ли эти нервы в нормальной функции кожи или они модулируют заболевание.

После освоения этой техники ее можно выполнять рутинно и надежно с минимальным стрессом для животного. После этой процедуры можно использовать такие методы, как аминофлуоресцентное окрашивание, чтобы подтвердить, полностью ли удалены нервы от кожи и нарушена ли экспрессия генов.