Развитие многоклеточного трехмерной модели Органотипической слизистой оболочки пищеварительного тракта человека Выращенный в условиях микрогравитации

Общая цель данной процедуры заключается в описании разработки многоклеточной трехмерной органотипической модели слизистой оболочки кишечника человека, культивируемой в условиях микрогравитации, обеспечиваемой биореакторами с вращающимися стенками сосуда. Этот метод имеет широкий потенциал в качестве инструмента для открытий как в области здоровья, так и в области болезней. В том числе взаимодействие с патогенами, трафик антигена и воспалительные процессы.

Основными преимуществами этой методики являются имитация фенотипического разнообразия кошки и использование сосудистых биореакторов D-12, которые обеспечивают эффективную диффузию питательных веществ и кислорода. Начните с того, что открутите крышку от заливного отверстия резервуара для культивирования и добавьте 50 миллилитров нашего PMI. Как только сосуд наполнится, установите крышку на место и протрите пролитую среду 70% этанолом.

Дайте сосуду поинкубироваться не менее 15 минут до ночи при комнатной температуре. Когда вы будете готовы продолжить, используйте заливное отверстие, чтобы сбросить питательную среду и добавьте 30 миллилитров 3-D питательной среды в сосуд. Установите на место крышку заливного отверстия и снова протрите пролитую среду 70% этанолом.

Извлеките из инкубатора соседние колбы, содержащие эндотелиальные клетки пупочной вены человека и фибробласты толстой кишки человека, и дважды промойте их PBS. Затем отделите клетки, покрыв их 0,25% раствором трипсина с 0,05% трипсина ЭДТА. Как только клетки отделятся, соберите их в 50-миллилитровую пробирку, предварительно загруженную 30 миллилитров DMEM, содержащей 30% FBS.

Центрифугируйте пробирку в течение 10 минут, чтобы гранулировать клетки. Затем повторно суспендируйте клетки в 30 миллилитрах DMEM, содержащем 30% FBS. Далее разведите 20 микролитров повторно суспендированных клеток 20 микролитрами трипанового синего красителя.

Загрузите в гемоцитометр клеточную смесь и подсчитайте концентрацию жизнеспособных клеток. Затем повторно суспендируйте каждый тип клеток в концентрации от 50 до 80 миллионов клеток на миллилитр в DMEM, содержащем 30% FBS. Во-первых, поместите соответствующее количество культуральных вкладышей в лунки шестилуночной пластины.

Затем приготовьте коллагеновую смесь, сначала добавив 10x DMEM, 10x Reconstitution Media, 200 миллимоляров L-глутамина и нагрейте инактивированный FBS в 50-миллилитровую коническую трубку. Затем добавьте бычий коллаген первого типа, ламинин, коллаген четвертого типа, фибронектин, гепарин сульфат, протеогликан и, наконец, добавьте гидроксид натрия для нейтрализации pH раствора. Если в какой-то момент смесь приобретает желтоватый цвет кислого вида, добавьте несколько капель стерильного 1 нормального гидроксида натрия для нейтрализации смеси.

Закройте пробирку и перемешайте раствор, перевернув его несколько раз, избегая образования пузырьков. Когда раствор не смешивается, держите его на льду, чтобы предотвратить его полимеризацию. После смешивания добавьте клеточные суспензии в коллагеновый препарат и перемешайте пробирки, осторожно перевернув пробирки несколько раз, чтобы избежать образования пузырьков.

Затем положите их обратно на лед. Добавьте четыре-пять миллилитров клетки, содержащей раствор коллагена, в каждую вставку и дайте коллагену образоваться в капюшоне практически без движения в течение одного часа. Через час перенесите планшет с шестью лунками в инкубатор еще на один-два часа.

Далее верните пластину в капюшон для культуры тканей и с помощью пары стерильных щипцов и скальпеля асептически разрежьте мембрану от вставки. Отделите клетку, содержащую гель, от мембраны, а затем разрежьте отделенный гель на небольшие квадраты. Добавьте маленькую клетку, содержащую квадраты коллагена, в один из предварительно заполненных 50 миллилитровых сосудов с помощью отверстия для наполнения.

Затем приготовьте суспензию эпителиальных клеток человека HCT-8, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Повторно суспендируйте клетки в концентрации 10 миллионов клеток на миллилитр в DMEM, содержащем 30% FBS. Затем добавьте один миллилитр клеточной суспензии HCT-8 в 50-миллилитровый сосуд с помощью его заполняющего отверстия.

После добавления клеток добавьте еще 20 миллилитров 3-D питательной среды в сосуд так, чтобы он был почти полным. Установите крышку на место и намочите кромку заливного отверстия 70% этанолом. Затем поместите пятимиллилитровый шприц, содержащий от трех до четырех миллилитров 3-D питательной среды, в одно отверстие сосуда и пустой пятимиллилитровый шприц в другой порт

Удалите все видимые пузырьки, втягивая их в пустой шприц, в то время как примерно такой же объем среды вводится через другой шприц в сосуд. Удалив весь воздух, поместите сосуды в биореактор, включите питание и установите скорость от 13 до 14 оборотов в минуту. При необходимости отрегулируйте скорость, чтобы клетки не соприкасались со стенками сосудов.

Культивируйте клетки под действием микрогравитации и меняйте питательную среду каждые три-четыре дня. Чтобы сменить среду, используйте метод двойного шприца, чтобы заменить примерно 30 миллилитров используемой среды свежей 3-D питательной средой. После трех-пяти дней культивирования изолируйте мононуклеарные клетки периферической крови, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.

Затем извлеките сосуд из биореактора и добавьте в сосуды примерно 20 миллионов клеток, состоящих из лимфоцитов и моноцитов, через заливное отверстие. Поместите сосуды обратно в биореактор и культивируйте еще на четыре-шесть дней. Примерно на девятый день культивирования добавьте в сосуд еще 20 миллионов клеток, состоящих из лимфоцитов и моноцитов, и продолжайте культивирование в течение еще 12 дней.

В конце эксперимента с помощью переводной пипетки соберите каждый маленький фрагмент геля, который теперь называется конструкцией, и поместите их в лунки шестилуночной пластины, содержащей 10 миллилитров 10% формалинового буфера. Зафиксируйте конструкции в течение трех часов при комнатной температуре, а затем приступайте к стандартным протоколам гистологического встраивания, среза и окрашивания. Методы, представленные в этом видео, позволяют создать многоклеточную 3D-органотипическую модель слизистой оболочки кишечника человека.

В культуре микрогравитации клетки становятся хорошо дифференцированными и формируют упорядоченные, похожие на ворсинки признаки к 20-му дню. После освоения этой техники ее можно выполнить за шесть часов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости придерживаться хороших рекомендаций по выращиванию клеточных культур.

Крайне важно систематически контролировать жизнеспособность клеток, контаминацию микоплазмами и изменения в поведении клеток при росте. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммуногистохимия, для выявления маркеров линии и дифференцировки клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как разработать многоклеточную 3-D органотипическую модель слизистой оболочки кишечника человека, культивируемой в условиях микрогравитации.