Развитие многоклеточного трехмерной модели Органотипической слизистой оболочки пищеварительного тракта человека Выращенный в условиях микрогравитации
25 июля 2016 г.
Клетки , растущие в трехмерной (3-D) среды представляют собой значительное улучшение по сравнению с выращиванием клеток в 2-D средах (например, колбах или блюда). Здесь мы опишем развитие многоклеточного 3-D модели органотипического слизистой оболочки кишечника человека, культивируемых в условиях микрогравитации, представленной вращающейся стенки сосуда (RWV) биореакторах.
Общая цель данной процедуры — описать разработку многоклеточной трехмерной органотипической модели слизистой оболочки кишечника человека, культивируемой в условиях микрогравитации с использованием биореакторов с вращающейся стенкой. Этот метод обладает широким потенциалом в качестве инструмента для исследований как в норме, так и при патологии, включая изучение взаимодействий с патогенами, транспорта антигенов и воспалительных процессов.
Основными преимуществами данного метода являются имитация фенотипического разнообразия кошки и использование биореакторов в сосудах D-12, которые обеспечивают эффективную диффузию питательных веществ и кислорода. Начните с отвинчивания крышки из заправочного отверстия культурального сосуда и добавления 50 milliliters нашей среды PMI. Как только сосуд будет заполнен, закройте его крышкой и протрите пролитую среду 70%ethanol.
Инкубируйте сосуд при комнатной температуре от 15 минут до ночи. Когда будете готовы продолжить, через заправочное отверстие удалите культуральную среду и добавьте в сосуд 30 milliliters среды для 3-D культивирования. Закройте заправочное отверстие крышкой и снова протрите любые пролитые капли среды 70% ethanol.
Извлеките из инкубатора почти полностью заполненные флаконы с эндотелиальными клетками пупочной вены человека и колоническими фибробластами человека и дважды промойте их PBS. Затем отделите клетки, покрыв их 0.25% раствором трипсина с 0.05% трипсин-ЭДТА. После того как клетки отделятся, соберите их в пробирку объемом 50 milliliter, предварительно наполненную 30 milliliters DMEM, содержащего 30% FBS.
Центрифугируйте пробирку в течение 10 минут для осаждения клеток. Затем ресуспендируйте клетки в 30 milliliters DMEM, содержащего 30% FBS. Далее разведите 20 microliters ресуспендированных клеток 20 micro-liters красителя трипановый синий.
Занесите клеточную смесь в гемоцитометр и подсчитайте концентрацию жизнеспособных клеток. Затем ресуспендируйте каждый тип клеток в концентрации от 50 до 80 миллионов клеток на мл в среде DMEM, содержащей 30% FBS. Сначала поместите соответствующее количество культуральных вставок в лунки шестилуночного планшета.
Затем приготовьте коллагеновую смесь, сначала добавив 10x DMEM, 10x Reconstitution Media, 200 millimolar L-glutamine и термоинактивированный FBS в коническую пробирку объемом 50 milliliter. Затем добавьте бычий коллаген I типа, ламинин, коллаген IV типа, фибронектин, гепарансульфат-протеогликан и, наконец, добавьте гидроксид натрия для нейтрализации pH раствора. Если в какой-либо момент смесь приобретает желтоватый оттенок, характерный для кислой среды, добавьте несколько капель стерильного 1 normal гидроксида натрия для нейтрализации смеси.
Закройте пробирку и перемешайте раствор, несколько раз перевернув ее, избегая образования пузырьков. В перерывах между перемешиванием держите раствор на льду, чтобы предотвратить его полимеризацию. После перемешивания добавьте клеточные суспензии в коллагеновый препарат и аккуратно переверните пробирки несколько раз, чтобы перемешать содержимое, избегая образования пузырьков.
Затем снова поместите их на лед. Добавьте от четырех до пяти миллилитров раствора коллагена с клетками в каждый инсерт и оставьте коллаген для гелеобразования в вытяжном шкафу в течение одного часа, избегая или максимально ограничив перемещение пластин. Через один час перенесите six-well планшет в инкубатор еще на один-два часа.
Затем верните планшет в ламинарный шкаф и с помощью стерильного пинцета и скальпеля в асептических условиях вырежьте мембрану из вставки. Отделите гель с клетками от мембраны, после чего разрежьте отделенный гель на маленькие квадраты. Поместите маленькие квадраты коллагена с клетками в один из предварительно заполненных сосудов объемом 50 milliliter через загрузочное отверстие.
Затем приготовьте суспензию эпителиальных клеток человека HCT-8, как описано в сопровождающем текстовом протоколе. Ресуспендируйте клетки до концентрации 10 million cells per milliliter в среде DMEM, содержащей 30%FBS. После этого добавьте один milliliter суспензии клеток HCT-8 в сосуд объемом 50 milliliter через заправочное отверстие.
После добавления клеток долейте в сосуд еще 20 мл среды для 3-D культивирования, чтобы он был почти заполнен. Закройте крышку и смочите края заправочного порта 70% этанолом. Затем вставьте в один порт сосуда шприц объемом 5 мл, содержащий от трех до четырех мл среды для 3-D культивирования, а в другой порт — пустой шприц объемом 5 мл.
Удалите все видимые пузырьки воздуха, перетягивая их в пустой шприц, в то время как примерно такой же объем среды вводится через другой шприц в сосуд. После полного удаления воздуха поместите сосуды в биореактор, включите питание и установите скорость вращения от 13 до 14 оборотов в минуту. При необходимости отрегулируйте скорость так, чтобы предотвратить контакт клеток со стенками сосуда.
Культивируйте клетки в условиях микрогравитации и меняйте культуральную среду каждые три-четыре дня. Для замены среды используйте метод с двумя шприцами, чтобы заменить примерно 30 milliliters использованной среды на свежую среду для 3-D культивирования. После трех-пяти дней культивирования выделите мононуклеарные клетки периферической крови, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.
Затем извлеките сосуд из биореактора и через загрузочное отверстие добавьте в него примерно 20 миллионов клеток, состоящих из лимфоцитов и моноцитов. Поместите сосуды обратно в биореактор и культивируйте в течение еще четырех-шести дней. Примерно на девятый день культивирования добавьте в сосуд еще 20 миллионов клеток, состоящих из лимфоцитов и моноцитов, и продолжайте культивирование до 12 дополнительных дней.
По окончании эксперимента с помощью переносной пипетки соберите каждый небольшой фрагмент геля, который теперь называется конструктом, и поместите их в лунки шестилуночного планшета, содержащего 10 milliliters 10% формалинового буфера. Фиксируйте конструкты в течение трех часов при комнатной температуре, после чего приступайте к стандартным протоколам гистологической заливки, изготовления срезов и окрашивания. Методы, представленные в данном видео, позволяют создать многоклеточную 3-D органотипическую модель слизистой оболочки кишечника человека.
При культивировании в условиях микрогравитации клетки становятся хорошо дифференцированными и к 20-му дню формируют упорядоченные ворсинчатые структуры. После освоения эта методика может быть выполнена за шесть часов при условии правильного соблюдения протокола. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости придерживаться принципов надлежащей практики культивирования клеток.
Крайне важно систематически контролировать жизнеспособность клеток, отсутствие микоплазменного загрязнения и изменения в динамике их роста. После выполнения данной процедуры можно применять другие методы, такие как иммуногистохимия, для идентификации маркеров клеточной линии и дифференцировки клеток. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создать многоклеточную 3-D органотипическую модель слизистой оболочки кишечника человека, культивируемую в условиях микрогравитации.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается разработка многоклеточной трехмерной органотипической модели слизистой оболочки кишечника человека, культивируемой в условиях микрогравитации с использованием биореакторов с вращающейся стенкой (RWV). Этот инновационный подход улучшает культивирование клеток по сравнению с традиционными двухмерными методами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследования в условиях микрогравитации
Теоретические сведения
- 3-D модели клеточных культур лучше имитируют условия in vivo.
- Среды с микрогравитацией могут влиять на поведение и взаимодействия клеток.
- Биореакторы с вращающимся стенками облегчают диффузию питательных веществ и кислорода.
- Понимание строения слизистой оболочки кишечника имеет решающее значение для исследований здоровья и заболеваний.
Цель исследования
- Разработать трехмерную органотипическую модель слизистой оболочки кишечника человека.
- Изучить клеточные взаимодействия в условиях микрогравитации.
- Создать платформу для исследования механизмов здоровья и патологических процессов.
Используемые методы
- Использование биореакторов с вращающейся стенкой для культивирования клеток.
- Создание многоклеточной модели для имитации слизистой оболочки кишечника.
- Оценка клеточных взаимодействий и ответов.
- Оценка эффективности диффузии питательных веществ и кислорода.
Основные результаты
- 3D-модель успешно имитировала фенотипическое разнообразие клеток кишечника.
- Условия микрогравитации повлияли на поведение и взаимодействие клеток.
- Модель продемонстрировала потенциал для изучения взаимодействия патогенов и воспалительных процессов.
- В установке биореактора была достигнута эффективная диффузия питательных веществ и кислорода.
Выводы
- Разработанная модель представляет собой значительный шаг вперед в технологии культивирования клеток.
- Она позволяет по-новому взглянуть на здоровье кишечника и механизмы развития заболеваний.
- Данный подход может стать ценным инструментом для будущих биомедицинских исследований.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Эта многоклеточная трехмерная органотипическая модель слизистой оболочки кишечника человека, выращенная в условиях микрогравитации, представляет собой физиологически релевантную систему для изучения взаимодействий между хозяином и патогеном, транспорта антигенов и воспалительных процессов. Благодаря имитации архитектуры тканей и клеточного разнообразия in vivo, данная модель повышает прогностическую достоверность при доклинической валидации мишеней и снижении рисков при изучении механизмов. Она обеспечивает трансляционную преемственность от этапа поиска до доклинических стадий, позволяя проводить воспроизводимую количественную оценку ответов слизистой оболочки в системе, релевантной патологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся взаимодействий между эпителием и иммунными клетками в многоклеточной модели слизистой оболочки кишечника человека.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней за счет поддержания дифференцированных ворсинкоподобных структур в условиях микрогравитации.
- Прогностическая ценность: снижает механистическую неопределенность при подборе мишеней на ранних этапах за счет моделирования сложности слизистой оболочки человека.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений, влияющих на барьерную функцию или иммуномодуляцию.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет культивирования в условиях контролируемой микрогравитации и заданных соотношений при посеве клеток.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы в нескольких экспериментальных циклах с формированием стабильных конструктов к 20-му дню.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: Моделирует слизистую оболочку кишечника человека с эпителиальными, эндотелиальными компонентами, фибробластами и лимфоцитами для исследований заболеваний.
- Преклиническая преемственность: Поддерживает принятие обоснованных решений по снижению рисков за счет возможности долгосрочного культивирования до 30 дней с сохранением стабильных фенотипических признаков.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет оценивать воспалительные процессы и взаимодействие с патогенами в контролируемой системе, производной от клеток человека.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс разработки препаратов — от ранней валидации мишеней до доклинического моделирования, что особенно актуально для направлений, ориентированных на желудочно-кишечный тракт и иммунологию.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез об иммунном ответе слизистой оболочки и целостности эпителия в релевантной для человека 3-D системе.
- Скрининг: предоставляет количественные данные посредством гистологического и иммуногистохимического анализа после фиксации и срезания конструкта.
- Аналитика: позволяет сравнивать клеточную локализацию, маркеры дифференцировки и структурную организацию при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает результаты фундаментальных открытий с доклинической валидацией за счет длительного культивирования многоклеточных конструктов.
- Повторное использование в масштабе предприятия: создает стандартизированную платформу на базе вращающегося биореактора, применимую для различных моделей заболеваний кишечника.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Прогностическая достоверность за счет фенотипической диверсификации и ворсинчатого морфогенеза в условиях микрогравитации.
- Практическая ценность: Стандартизация посредством определенного посева клеток, гелеобразования коллагена и контроля скорости биореактора (13–14 rpm).
- Стратегическая ценность: Улучшение принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения риска неудач на поздних стадиях из-за неправильного выбора слизистых мишеней.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию кандидатов с учетом рисков на основе эффектов в сложной кишечной модели человеческого происхождения.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в изоляции первичных клеток, подготовке 3-D гелей и работе с биореакторами.
- Зависимость от биореакторов с вращающейся стенкой (HARV/STLV) и стерильного перемещения жидкостей без образования пузырьков.
- Необходима межкомандная стандартизация источников клеток, смешивания коллагена и графиков смены среды.
- При адаптации метода следует учитывать масштабирование типов и соотношений клеток для различных отделов слизистой или патологических состояний.
- Практические ограничения включают длительные сроки культивирования (до 30 дней) и чувствительность к напряжению сдвига при неправильно подобранной скорости биореактора.
