Очищенные визуализации эмбрионального и постнатального Сердца в одноклеточные Разрешение

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы объемно визуализировать флуоресцентные клетки, меченные белками, глубоко внутри интактных сердец, изучить функцию генов с разрешением одной клетки во время сердечного развития и в постнатальном сердце. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы во время развития сердца, такие как изучение функций генов и помощь в получении изображений с разрешением отдельных клеток во время развития сердца и анимидных артефактов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он относительно прост, недорог и выгоден в том смысле, что специальный временной анализ функций гена и белка при разрешении одной клетки в интактном эмбрионе или сердце

Хотя мы используем эту систему для изучения развития сердца у мышей, вы также можете использовать ее для изучения других систем органов, таких как мышцы, мозг и легкие, а также других модельных организмов. Здесь используются флуоресцентные белковоположительные эмбрионы из обработанных тамоксифреном дамов R-26 Cre-RET2 для конфетти. Начните окрашивание с погружения каждого параформальдегид-фиксированного эмбриона в один миллилитр 0,1% PBST в лунки 48-луночного планшета.

Выдерживайте в течение двух часов в шейкере при комнатной температуре, чтобы ткани пропитались. Затем замените раствор для пермеабилизации одним мл блокирующего буфера и инкубируйте, встряхивая, в течение двух часов при комнатной температуре или в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Затем приготовьте разведение 1 к 100 специфического антитела к эндотелиальным клеткам, PECAM, в 0,3 мл блокирующего буфера для каждой лунки и добавьте его в лунки, содержащие эмбрионы.

Выдерживать в течение 48 часов при встряхивании при четырех градусах Цельсия. После инкубации пятикратно промойте эмбрионы PBST в течение 30 минут каждый раз, чтобы удалить избыток первичных антител из тканей. Затем погрузите эмбрионы в раствор вторичного антитела Alexa Fluor 647 для козьего антивата и инкубируйте с встряхиванием в течение 48 часов при температуре четыре градуса Цельсия, находясь в защищенном от света месте.

Через 48 часов, после предварительного вымывания зафиксируйте эмбрионы 4% PFA в течение одного часа при комнатной температуре с встряхиванием. Затем, после двукратной промывки PBS в течение пяти минут каждый раз, инкубируйте эмбрионы с ядерным окрашиванием DAPI в течение десяти минут. Затем проведите два омовения PBS по пять минут каждое, затем приступайте к очищению тканей.

Очищение тканей является наиболее важным этапом в этом протоколе для получения изображений сердца с разрешением одной клетки. Кроме того, выбор метода очищения от чешуи или CUBIC также очень важен для сохранения флуоресцентных сигналов в интактном эмбриональном сердце. Переложите промытые, окрашенные эмбрионы в сцинтилляционный флакон, завернутый в алюминиевую фольгу, в котором содержится один миллилитр раствора накипи А2.

Инкубировать при температуре четыре градуса Цельсия с редким легким встряхиванием рукой в течение 48 часов. После инкубации весов А2 замените раствор во флаконе одним миллилитром раствора накипи В4, и инкубируйте при четырех градусах Цельсия с периодическим легким встряхиванием еще 48 часов. Инкубируйте эмбрионы еще 48 часов с помощью одного миллилитра чешуи 70 при четырех градусах Цельсия, время от времени осторожно встряхивая, как и раньше.

Наконец, погрузите очищенный от накипи образец в один миллилитр 90% глицерина и храните при температуре четыре градуса Цельсия до получения изображения. Для получения изображения перенесите образец в чашку Петри со стеклянным дном с минимальным количеством глицерина 90% и сделайте изображение с помощью конфокального микроскопа, оснащенного двухфотонными возможностями. Для очистки CUBIC погрузите каждый эмбрион в один миллилитр CUBIC с редким легким встряхиванием в течение 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия.

Через 48 часов замените раствор тем же объемом свежего реагента CUBIC one и инкубируйте образец еще 48 часов, как и раньше. После инкубации несколько раз промыть обработанные CUBIC эмбрионы PBS с легким встряхиванием вручную, чтобы удалить излишки раствора CUBIC one. Затем погрузите эмбрионы в раствор CUBIC two на 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия, время от времени осторожно встряхивая рукой.

Если перед визуализацией будет задержка, последовательно инкубируйте образцы с одним миллилитром 30% 50% и 70% глицерина и PBS в течение 30 минут каждый. После перемещения по ряду переложите в 90%-ный раствор глицерина для хранения при четырех градусах Цельсия. Когда все будет готово, изобразите изображение в чашке петри со стеклянным дном с 90% глицерина, как и раньше.

В этом ролике показаны оптические срезы обработанного окалиной сердца E 8.75, от поверхности сердца до просвета. Желтым цветом отмечена экспрессия PECAM, а все кардиомиоциты отображаются зеленым. Глубина составляет 110,4 мкм, всего насчитывается 93 среза.

Это только что показанное 3D-изображение поверхности реконструированного сердца. Опять же, желтым цветом обозначена экспрессия PECAM, а зеленым – все кардиомиоциты. В этом фильме показаны фрагменты одного клона-предшественника из обработанного окалиной сердца E 9.5 в области выходного тракта.

Желтым цветом обозначено выражение PECAM, а зеленым цветом обозначен клон. Глубина составляет 36 мкм, всего имеется 10 срезов. В этом видеоролике показаны участки обработанного CUBIC P two сердца от поверхности до просвета.

Глубина составляет 130 мкм по три мкм на секцию. В этом видеоролике показаны участки обработанного CUBIC сердца E 17.5 от поверхности до просвета. Глубина составляет 630 мкм, по шесть мкм на секцию.

Это только что показанное 3D-изображение поверхности сердца, реконструированное с помощью программного обеспечения для 3D-реконструкции. При попытке проведения этой процедуры важно помнить, что эмбрион хрупкий и сердечную патологию можно легко нарушить. После этой процедуры можно получить другой белок, используя окрашивание для изучения функции гена в постостлатентном периоде и вспенивания.