Анализ кардиомиоцитов развития с помощью иммунофлюоресценции в эмбриональных мыши Сердце

Общая цель данной процедуры заключается в оценке созревания миофибрилл и кардиомиоцитов в развивающемся эмбриональном сердце мыши. Для этого сначала проводят ориентацию и замораживание эмбрионального сердца в среде для срезания. Затем сердце подвергают криосекционированию в соответствующей ориентации.

Затем срезы сердца подвергают иммунофлуоресцентному мечению интересующих белков. В завершение проводится конфокальная микроскопия иммуноокрашенных срезов сердца. В конечном итоге для демонстрации развития MyFi и других структур кардиомиоцитов используется двухмерный и трехмерный анализ изображений.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития сердца, такие как влияние мутаций и сердечных генов на сборку MyFi и формирование специфических структур, таких как вставочные диски и костумеры. Для мгновенной заморозки сердец эмбрионов используйте оптимальную среду для криостатистики (OCT), заполнив ею чашку Петри диаметром 3,5 сантиметра в вытяжном шкафу. Охладите 2-метилбутан в жидком азоте.

После выделения эмбриональных сердец мыши согласно текстовому протоколу, поместите сердца в OCT и дайте им уравновеситься в течение нескольких секунд перед переносом в семимиллиметровую форму, содержащую OCT. Расположите внутреннюю стенку сердца к дну формы. Осторожно поместите форму в 2-метилбутан, охлажденный жидким азотом.

Следите за тем, чтобы жидкость 2-метилбутан не соприкасалась с OCT или сердцем до тех пор, пока OCT не станет однородно белого цвета. Затем перенесите форму в ведерко со льдом, содержащее сухой лед. После полного замораживания всех сердец оберните криоформы фольгой и храните при температуре -80 °C до начала криосекционирования.

Для фиксации сердец эмбрионов используйте 4% PFA в PBS, заполнив ими лунки 12-луночного планшета для культивирования. После извлечения сердец эмбрионов согласно текстовому протоколу поместите каждое сердце в лунку с PFA и фиксируйте при температуре четырех градусов Цельсия в течение ночи. Для криопротекции сердец с помощью пластической переносной пипетки перенесите каждое сердце в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 1,5 миллилитра 15% Sucrose в PBS, и осторожно перемешивайте при температуре четырех градусов Цельсия до тех пор, пока сердце не осядет на дно пробирки. Перенесите каждое сердце в 30% sucrose в PBS и осторожно перемешивайте при температуре четырех градусов Цельсия до тех пор, пока сердце не осядет на дно пробирки.

Заморозьте эмбрионы в OCT, как было показано ранее в этом видео. После помещения криоформ в камеру криостата и достижения температуры -17 °C переверните криоформу и, приложив осторожное давление, извлеките блок сердца из формы. Ориентируйте переднюю стенку сердца так, чтобы она была обращена к верхней части сформированного блока ткани.

Нанесите большую каплю OCT на зажим и закрепите блок сердца на этой капле. Расположите образец так, чтобы передняя стенка сердца была максимально удалена от зажима. Дождитесь полного замораживания сердца на зажиме.

Установите патрон с закрепленным блоком сердца на предметный держатель криостата. Отрегулируйте положение так, чтобы угол наклона ножа по отношению к образцу составлял от трех до пяти градусов. Соберите срезы толщиной 10 µm на предметные стекла, предварительно обработанные положительно заряженным покрытием.

Дайте образцам полностью высохнуть перед хранением при −80 °C для последующего проведения иммунофлуоресценции. После фиксации и/или удаления OCT из срезов используйте 1х блокирующий буфер, разведенный в PBS, для блокировки в течение 45 минут при осторожном перемешивании. При использовании первичных антител, полученных в мыши, добавьте моновалентный FAB-фрагмент антител осла или козы против IgG мыши (H + L), разведенный 1:100 в PBS с 0,1% Tween 20, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 минут при осторожном перемешивании.

Добавьте первичные антитела, разведенные в одном объеме блокирующего буфера, и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре или в течение ночи при четырех градусах Цельсия. После инкубации промойте срезы один раз в 1XPBS, повторив процедуру трижды по 10 минут. При комнатной температуре добавьте к образцам конъюгированные вторичные антитела, разведенные в блокирующем буфере в соотношении 1:500, и инкубируйте в течение двух часов в защищенном от света месте.

При комнатной температуре трижды промойте срезы раствором XPBS по 10 минут каждый раз, защищая их от света. Закрепите стекла, нанеся по две капли антифейдинговой среды на каждый конец стекла, и накройте покровным стеклом. Загерметизируйте края покровных стекол с помощью лака для ногтей.

Храните образец при температуре 4 °C в защищенном от света месте до начала визуализации. Используя объектив с увеличением 4x и лазерную флуоресценцию, найдите образец и интересующую область. Сделайте снимок, который будет использоваться в качестве карты.

При получении изображений с большим увеличением извлеките предметное стекло, максимально ограничив перемещение предметного столика. Затем переключитесь на иммерсионный объектив 60 x.

Нанесите небольшую каплю иммерсионного масла на объектив и верните предметное стекло на предметный столик. Затем снова найдите образец, установите мощность лазера, время экспозиции и биннинг на нужные уровни для каждого канала. После определения оптимальных настроек в соответствии с рекомендациями текстового протокола используйте эти параметры для всех срезов ткани в рамках данного эксперимента.

Используйте гистограмму интенсивности, чтобы определить оптимальный диапазон интенсивности для каждого канала, который будет использоваться при анализе. Создайте Z-стек с помощью функции сбора данных, выбрав соответствующие лазерные каналы. Затем установите верхнюю и нижнюю границы Z-стека.

Выберите размер шага Zack, который в два раза меньше значения толщины оптического среза, указанного в программном обеспечении. Нажмите «run» (запуск), чтобы собрать изображения с помощью Fiji или аналогичной программы для анализа изображений. Откройте файл Zack с использованием опции пользовательского цветового режима и разделением каналов по отдельным окнам.

В выпадающем меню «Image» откройте инструмент «Adjust Brightness/Contrast» и для каждого канала установите оптимальный диапазон интенсивности гистограммы. Примените эти диапазоны каналов ко всем анализируемым Z-стекам, как было определено ранее. Затем в выпадающем меню «Image» -> «Color» объедините отдельные каналы в одно композитное изображение.

Используя меню Image Stacks Z project, создайте проекцию Z-стека (flattened Z stack) из композитного изображения. Поскольку это изображение будет значительно ярче, чем 3D-изображение, отрегулируйте диапазон интенсивности гистограммы для контрольного образца, чтобы избежать перенасыщения, и примените те же настройки к экспериментальному проекционному стеку. Для генерации 3D-изображения сначала выберите меню Image Stacks 3D project. Выберите ось вращения X или Y.

Установите расстояние между срезами в микронах равным размеру шага Z-стека. Выберите желаемый общий угол поворота и установите приращение угла поворота равным единице. Затем откройте 3D-визуализатор ImageJ через выпадающее меню плагинов (plugins).

Выберите отображение сгенерированного композитного изображения в виде объема и установите коэффициент ресемплирования на один или два. На этих рисунках представлены типичные результаты ко-окрашивания различных белков в мгновенно замороженном и фиксированном ацетоном сердце: антитело к $\alpha$-актинину воспроизводимо и со специфичностью метиловала Z-диски и интеркалярные диски при минимальном фоне. Антитело к белку адгезионных соединений $\beta$-катенину связалось с мембранами как кардиомиоцитов, так и некардиомиоцитарных клеток, при этом колокализация с $\alpha$-актинином наблюдалась в предполагаемых интеркалярных дисках на стадии E 16.5. Иммунофлуоресцентное окрашивание $\beta_1$-интегрина в эмбриональном сердце представляет особую сложность, однако окрашивание $\beta_1$-интегрина в данных исследованиях выявило сигнал с той же периодичностью, что и Z-диски, меченные $\alpha$-актинином, что, возможно, отражает формирование зародышевых костамеров на стадии E 16.5.

На стадии E 12.5 характер окрашивания на SFA-актинин и тропомиозин в трабекулярных кардиомиоцитах демонстрировал регулярную периодичность, соответствующую зрелым миофибриллам; в наружной компактной зоне окрашивание на SFA-актинин было более пунктирным, чем линейным, а сигнал тропомиозина был диффузным, а не линейным. NCA-адгезивное окрашивание и трабекулярные кардиомиоциты в сердцах на стадии E 12.5 колокализовались с областями интенсивного окрашивания на SFA-актинин, что, возможно, представляет собой вставочные диски. Здесь показано A фиксированное PFA эмбриональное сердце на стадии E 12.5, меченное на SFA-актинин и фибриллярный актин от трансгенной мыши life act RFP Ruby. Отношение сигнал/шум для SFA-актина было снижено по сравнению с моментально замороженными срезами сердца.

Трехмерная реконструкция изображений показала, что миофибриллы (MyFi) внутри кардиомиоцита расположены примерно параллельно друг другу, однако отдельные кардиомиоциты ориентированы под разными углами по отношению друг к другу. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как правильно ориентировать и криорезать эмбриональные сердца, а также проводить иммуноокрашивание, конфокальную микроскопию и анализ изображений для оценки созревания MyFi и кардиомиоцитов в процессе развития сердца мыши.