Анализ кардиомиоцитов развития с помощью иммунофлюоресценции в эмбриональных мыши Сердце

Общей целью этой процедуры является оценка созревания миофиалов и кардиомиоцитов в развивающемся эмбриональном сердце мыши. Это достигается путем предварительной ориентации и замораживания сердца эмбриона в режущей среде. Далее сердце крио разрезается в правильной ориентации.

Затем отделы сердца подвергаются иммунофлуоресцентному мечению интересующих белков. Наконец, проводится конфокальная микроскопия иммуноокрашиваемых срезов сердца. В конечном счете, двухмерный и трехмерный анализ изображений используется для демонстрации развития MyFi и других кардиомиоцитарных структур.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития сердца, например, как мутации и сердечные гены влияют на сборку MyFi и появление конкретных структур, таких как межпозвоночные диски и клиенты. Чтобы заморозить эмбриональные сердца, используйте оптимальную температуру резки или ОКТ-среду, чтобы заполнить 3,5-сантиметровую чашку Петри в химическом колпаке. Классно. Два метилбутана в жидком азоте.

После изоляции эмбриональных сердец мыши в соответствии с текстовым протоколом поместите сердца в ОКТ и дайте им уравновеситься в течение нескольких секунд, прежде чем перенести их в семимиллиметровую форму, содержащую ОКТ. Ориентируйте внутреннюю стенку сердца на дно формы. Аккуратно поместите форму в жидкостный азот, охлажденный двумя метилбутанами.

Следите за тем, чтобы жидкость с двумя метилбутанами не соприкасалась с ОКТ, или сердце замерзало до тех пор, пока ОКТ не станет сплошным белым. Затем переложите форму в ведро со льдом, содержащее сухой лед. После того, как все сердца будут заморожены, заверните криоформы в фольгу и храните ее при температуре минус 80 градусов Цельсия до готовности к криосекции.

Чтобы зафиксировать сердца эмбрионов, используйте 4% PFA в PBS для заполнения лунок культивальной пластины из 12 фольги. После вскрытия эмбриональных сердец в соответствии с текстовым протоколом поместите каждое сердце в лунку с PFA и зафиксируйте при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. Переведите каждое сердце на 30% сахарозу в PBS и осторожно взбалтывайте при четырех градусах Цельсия, пока сердце не опустится на дно трубки.

Заморозьте эмбрионы в ОКТ, как было показано ранее в этом видео. После помещения криоформ в камеру криостата и при температуре минус 17 градусов Цельсия переверните криоформу и с помощью легкого давления выдавите сердечный блок из формы. Ориентируйте переднюю стенку сердца на верхнюю часть формованного тканевого блока.

Поместите большую каплю ОКТ на патрон и установите сердечный блок на каплю ОКТ. Сохраняя ориентацию таким образом, чтобы передняя стенка сердца находилась дальше всего от лопатки. Дайте сердцу замерзнуть на патроне.

Загрузите патрон и установленный блок сердца на держатель объекта криостата. Отрегулируйте так, чтобы угол наклона лезвия составлял три-пять градусов относительно образца. Соберите срезы размером 10 микрометров на предметные стекла микроскопа, предварительно обработанные положительно заряженным покрытием.

Дайте образцам полностью высохнуть перед хранением при температуре минус 80 градусов Цельсия для проведения иммунофлюоресценции. После фиксации и/или удаления ОКТ из срезов используйте один блокирующий буфер, разведенный в PBS, для блокировки в течение 45 минут с легким встряхиванием. При использовании первичного антитела, полученного у мыши, добавьте ослику или козе антимышиный IgG H плюс L одновалентный фрагмент FAB, разведенный в соотношении 1:100 в PBS 0,1%tween 20, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 минут, слегка встряхивая.

Добавьте первичное антитело или антитела, разведенные в одном блокирующем буфере, и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре или при четырех градусах Цельсия в течение ночи. После инкубации с помощью одного XPBS промыть секции три раза в течение 10 минут. При комнатной температуре аддор конъюгированный вторичный антитело разводят один к 500 в блокирующем буфере к образцам и инкубируют в защищенном от света воздухе в течение двух часов.

При комнатной температуре с помощью одного XPBS промыть секции при комнатной температуре три раза в течение 10 минут в защищенном от света месте. Установите предметные стекла на средний уровень защиты от выцветания, поместив по две капли медиума на каждый конец предметного стекла, и используйте защитное стекло для покрытия. Используйте лак для ногтей, чтобы запечатать покровные стекла.

Храните его при температуре четыре градуса Цельсия, защищенном от света до готовности к изображению. Используя четырехкратный объектив и лазерную флуоресценцию, найдите образец и область интереса. Захватите изображение и используйте его в качестве карты.

При съемке с большим увеличением. Снимите слайд, внеся минимальные корректировки в слайд-сцену. Затем переключитесь на объектив с 60-кратным погружением в масло.

Нанесите небольшую каплю масла на объектив и установите предметное стекло на слайдовую сцену. Далее снова находим образец, устанавливаем время экспозиции мощности лазера и биннинг на нужные уровни для каждого канала. После того, как оптимальные настройки определены в соответствии с рекомендациями текстового протокола, используйте настройки образца для всех участков ткани в рамках эксперимента.

С помощью гистограммы интенсивности отметим оптимальный диапазон интенсивности для каждого канала, который будет использоваться для анализа. Сгенерируйте Zack с помощью функции захвата, выбрав соответствующие лазерные каналы. Затем выберите верхнюю и нижнюю границы стека Z.

Выберите размер шага Зака, равный половине значения толщины оптического среза, предоставленного программным обеспечением. Нажмите кнопку «Выполнить», чтобы собрать изображения с помощью Fiji или аналогичной программы для анализа изображений. Откройте файл Zack с пользовательским цветовым режимом, и каналы будут разделены на отдельные окна.

В раскрывающемся меню изображения откройте инструмент настройки яркости, контраста и для каждого канала установите оптимальный диапазон интенсивности гистограммы. Как было определено ранее, примените эти диапазоны каналов ко всем анализируемым Zack. Затем в раскрывающемся меню цвета изображения объедините отдельные каналы в одно составное изображение.

С помощью меню проекта Stacks Z создайте сплющенный стек Z из составного образа. Так как это изображение будет значительно ярче 3D-изображения, отрегулируйте диапазон интенсивности гистограммы для контрольного образца, чтобы избежать перенасыщения, и примените те же настройки к экспериментальному сплющенному Zack. Чтобы создать 3D-изображение, сначала выберите меню 3D-проекта стеков изображений. Выберите ось вращения по оси X или по оси Y.

Установите расстояние между срезами на том же количестве микрон, что и размер шага Z-стека. Выберите желаемое общее вращение и установите приращение угла поворота равным единице. Затем откройте просмотрщик изображения J 3D из выпадающего меню плагинов.

Выберите отображение сгенерированного составного изображения в качестве объема и установите коэффициент передискретизации равным одному или двум. Эти рисунки показывают типичные результаты для cos-окрашивания различных белков в мгновенно замороженном, с фиксированным ацетоном сердцем, антителом против S-альфа-актинина, воспроизводимо меченных Z-дисками, а также в интертентированных дисках с высокой специфичностью и минимальным фоном. Антитело против белка соединения адгезии бета-катенина связывало мембрану как кардиомиоцитов, так и некардиомиоцитарных клеток, и колокализация с актинином SFA происходила в предполагаемых интерактивных дисках при иммунофлуоресценции E 16,5 бета одного интегрина в эмбриональном сердце особенно сложна, но окрашивание бета одного интегрина в этих исследованиях выявило сигнал с той же периодичностью, что и меченные SFA актинином Z-диски. возможно, отражая зарождающихся клиентов, формирующихся в точке E 16.5.

При Е 12.5 паттерн окрашивания актинина и тропомицина СФА демонстрировал регулярную периодичность в трабекулярных кардиомиоцитах, соответствующую зрелым миофибриллам во внешней компактной зоне, актинин СФА был скорее пунктированным, чем линейным, и сигнал тропомиозина был диффузным, а не линейным адгезивным окрашиванием NCA, а трабекулярные кардиомиоциты в сердце Е 12.5 были локализованы с областями интенсивного окрашивания актинина СФА, возможно, представляющими собой интерактивные диски. Здесь показано эмбриональное сердце с фиксированным E 12,5 PFA, меченное на актинин SFA и филаментозный актон от трансгенной мыши RFP Ruby. Отношение сигнального сигнала к шуму актина SFA было снижено по сравнению с замороженными участками сердца.

Трехмерная реконструкция изображения показала, что MyFi внутри кардиомиоцитов были примерно параллельны друг другу, но отдельные кардиомиоциты были ориентированы под разными углами относительно друг друга. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как правильно ориентировать и криорезать сердца эмбрионов, а также выполнять иммуноокрашивание, конфокальную микроскопию и анализ изображений для оценки созревания MyFi и кардиомиоцитов во время развития сердца мыши. Признавать.