Визуализация клеточного цикла вариаций и определение нуклеации в послеродовом кардиомиоцитов

Общая цель данной процедуры — визуализация активности клеточного цикла в постнатальных кардиомиоцитах и определение их ядерности. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области регенерации сердца, такие как: действительно ли кардиомиоцит делится, или же он просто увеличивает свою плоидность или становится многоядерным? Основными преимуществами данной методики являются возможность визуализации М-фазы клеточного цикла с высоким пространственно-временным разрешением и возможность идентификации ядер кардиомиоцитов с помощью флуоресценции.

Процедуру продемонстрирует Патриция Фрайтаг, техник нашей лаборатории. При использовании негомозиготных breeding pairs сначала идентифицируйте трансгенные сердца с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы проверить экспрессию EGFP analin и H2B-mCherry. Ядерные сигналы EGFP analyin легче всего обнаружить по краям предсердий, фокусируясь через слои ткани.

Для выделения кардиомиоцитов поместите соответствующее количество сердец в реакционные пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 1 мл смеси ферментов из набора для диссоциации сердец новорожденных, и разрежьте сердца на мелкие кусочки ножницами. Затем перенесите раствор в реакционные пробирки объемом 15 мл. Поместите пробирку в почти горизонтальное положение при температуре 37 °C на 15 минут, перемешав ткань от 5 до 10 раз дозатором на 5 мл по окончании инкубации.

По завершении третьего этапа переваривания остановите реакцию, добавив 7,5 миллилитров среды два, и профильтруйте клеточную суспензию через 세포вый фильтр с размером пор 70 микрон. Промойте фильтр тремя миллилитрами среды два, объединив промывочный раствор с собранными клетками, и осадите клетки путем центрифугирования. Ресуспендируйте осадок в 500 микролитрах среды один для подсчета.

Затем высейте 1×10⁴ клеток на лунку в 120 µL среды one в 96-луночный планшет с плоским дном и центрифугируйте клетки перед их культивированием в инкубаторе для культур клеток в течение ночи. На следующий день большинство кардиомиоцитов должны начать сокращаться. Перед началом трансфекции протрите рабочую поверхность и все материалы для трансфекции раствором для деконтаминации РНКаз, чтобы удалить любые остатки РНКаз.

Когда все материалы будут готовы, добавьте по 20 µL свежеприготовленной смеси siRNA в каждую лунку и верните клетки в инкубатор на 48 часов. Через два дня замените супернатант в каждой лунке на 120 µL среды номер один и снова поместите клетки в инкубатор еще минимум на 24 часа. По окончании инкубации один раз промойте клетки PBS, после чего проведите фиксацию в 4% растворе формальдегида в течение 20 минут.

Для анализа клеток методом конфокальной видеомикроскопии перенесите планшет на предметный столик конфокального микроскопа и запустите программное обеспечение для визуализации. Откройте настройки A1plus и отметьте флажками каналы один, два, три и четыре. В выпадающем меню установите для первого канала DAPI, для второго — eGFP, для третьего — RFP, а для четвертого — Cy5.

Нажмите на напряжение канала и с помощью ползунков установите значение напряжения 80 для каждого канала. С помощью ползунков установите смещение на ноль и нажмите кнопку «Домой» (home), чтобы вернуть диафрагму в исходное положение. В выпадающем меню установите размер сканирования 1024 на 1024 пикселя.

Нажмите «optimize», чтобы открыть окно настройки размера XYZ, и установите флажок «perfect voxel» в разделе «suggested step Z». Выберите объектив 20x и отрегулируйте интенсивность лазера так, чтобы изображение не было ни недоэкспонированным, ни переэкспонированным. После настройки всех параметров откройте меню «acquire». Выберите «scan large image», затем в разделе «area» выберите «current position is at top left corner».

Затем установите количество полей по осям X и Y на три на три и нажмите «scan». Чтобы определить количество ядер кардиомиоцитов, нажмите «measure», затем «manual measurement» и «counts». Выберите ядра с сигналами H2B-mCherry, тем самым маркируя и подсчитывая их.

Затем выберите клетки, положительные по альфа-актинину, чтобы определить количество кардиомиоцитов. Для подсчета кардиомиоцитов в фазах G1, S и G2 с ядерными сигналами EGFP-аналина выберите «измерение» (measure), «ручное измерение» (manual measurement) и «подсчет» (counts). Отметьте ядра, экспрессирующие EGFP-аналин и H2B-mCherry, с помощью кликов и вручную подсчитайте кардиомиоциты с митоз-специфичными сигналами EGFP-аналина, такими как сократительные кольца и средние тельца.

Затем выберите «measure» (измерить), «manual measurement» (ручное измерение) и «counts» (подсчет), после чего отметьте кардиомиоциты с сигналами EGFP analin, специфичными для митоза: цитоплазматическими сигналами, сократительными кольцами и средними тельцами. По сравнению с отрицательным контролем, кардиомиоциты, трансфицированные miRNA и siRNA, демонстрируют индукцию клеточной активности. Кардиомиоциты, в которых происходит эндоредупликация, проявляют исключительно ядерную экспрессию EGFP analin, тогда как кардиомиоциты, подвергающиеся делению, демонстрируют экспрессию EGFP analin в локализациях, типичных для M-фазы.

После ферментативного расщепления тканей сердца на аппарате Лангендорфа предсердия и желудочки можно разделить механически и анализировать независимо друг от друга, что позволяет визуализировать трансгенные вентрикулярные кардиомиоциты H2B-mCherry с большим количеством бинуклеарных кардиомиоцитов, положительных по H2B-mCherry. Напротив, большинство кардиомиоцитов предсердий являются мононуклеарными. Ферментативное расщепление не приводит к получению 100% популяции одиночных клеток; при этом окрашивание на альфа-актинин выявляет структуру поперечного стриирования, что дополнительно облегчает дифференциацию бинуклеарных кардиомиоцитов, характеризующихся непрерывным рисунком поперечного стриирования, от клеточных дублетов.

Для анализа индекса бинуклеации кардиомиоцитов в толстых срезах необходимо вручную пролистывать стек, так как ядра не обязательно расположены в одной Z-плоскости; при этом окрашивание агглютинином зародышей пшеницы позволяет визуализировать границы клеток. 3D-реконструкции фиксированных срезов сердец взрослых трансгенных мышей позволяют обнаруживать и автоматически подсчитывать окрашенные и H2B-mCherry-положительные ядра для определения доли ядер кардиомиоцитов в ткани в физиологических условиях. После освоения методики диссоциация сердца может быть выполнена за два-три часа при условии правильного проведения процедуры.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости непрерывной работы для поддержания жизнеспособности клеток на протяжении всего эксперимента. После выполнения этой процедуры можно провести скрининг микроРНК или других малых молекул на предмет их способности индуцировать пролиферацию в постнатальных кардиомиоцитах.