Визуализация клеточного цикла вариаций и определение нуклеации в послеродовом кардиомиоцитов

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации активности клеточного цикла в постнатальных кардиомиоцитах и определении их нуклеарности. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенерации сердца, например, действительно ли кардиомиоциты делятся или они просто увеличивают свою плоидность или становятся многоядерными? Основные преимущества этого метода заключаются в том, что М-фаза клеточного цикла может быть визуализирована в высоком пространственно-временном разрешении, а ядра кардиомиоцитов могут быть идентифицированы с помощью флуоресценции.

Демонстрировать процедуру будет Патрисия Фрайтаг, техник из нашей лаборатории. При использовании негомозиготных скрещивающихся пар сначала определите трансгенные сердца с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы проверить их экспрессию аналина EGFP и H2B-mCherry. Ядерные сигналы EGFP analyin могут быть наиболее легко обнаружены по краям предсердий путем фокусировки через его тканевые слои.

Чтобы выделить кардиомиоциты, поместите соответствующее количество сердец в реакционные пробирки объемом 1,5 миллилитра, содержащие один миллилитр ферментной смеси из набора для диссоциации сердца новорожденных, и разрежьте сердца на мелкие кусочки ножницами. Затем переложите раствор в реакционные пробирки объемом 15 миллилитров. Поместите пробирку в почти горизонтальное положение при температуре 37 градусов Цельсия на 15 минут, перемешав ткань от пяти до 10 раз с помощью пятимиллилитровой пипетки в конце инкубации.

В конце третьего разложения остановите реакцию с 7,5 миллилитрами второй среды и отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатое фильтр для клеток размером 70 мкм. Промойте сетчатое фильтр с тремя миллилитрами среды два, объединив промывку с собранными клетками и соберите клетки центрифугированием. Повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитров средней для подсчета.

Затем засейте один раз по десять-четвертую клетки на лунку в 120 микролитров средней половины в 96-луночный планшет с плоским дном и центрифугируйте клетки перед их ночным культивированием в инкубаторе для клеточных культур. На следующий день большая часть кардиомиоцитов должна биться. Перед началом трансфекции протрите стол и все материалы для трансфекции раствором для обеззараживания РНКазы, чтобы удалить любую РНКазу.

Когда все материалы будут готовы, добавьте в каждую лунку по 20 микролитров свежеприготовленной смеси миРНК и верните клетки в инкубатор на 48 часов. Через двое суток замените надосадочную жидкость в каждой лунке на 120 микролитров средней и верните клетки в инкубатор еще как минимум на 24 часа. По окончании инкубации ячеек однократно промыть PBS с последующей фиксацией в 4%-ном растворе формальдегида в течение 20 минут.

Чтобы проанализировать клетки с помощью конфокальной видеомикроскопии, перенесите планшет на столик конфокального микроскопа и запустите программное обеспечение для визуализации. Откройте настройки A1plus и отметьте галочками первый, второй, третий и четыре каналы. В раскрывающемся меню установите для первого канала значение DAPI, для второго канала — значение eGFP, для третьего канала — значение RFP, а для четвертого канала — значение Cy5.

Нажмите на напряжение канала и с помощью ползунков установите напряжение на 80 для каждого канала. Используйте ползунки, чтобы установить смещение равным нулю, и нажмите кнопку «Домой», чтобы установить отверстие в исходное положение. Установите размер сканирования на 1024 на 1024 пикселя в раскрывающемся меню.

Нажмите «Оптимизировать», чтобы открыть окно настройки размера XYZ, и установите флажок идеального вокселя под предложенным шагом Z.Выберите объектив 20x и отрегулируйте интенсивность лазера, пока изображение не будет ни недоэкспонировано, ни переэкспонировано. Когда все параметры заданы, откройте меню получения. Выберите сканирование большого изображения, затем выберите текущее положение в верхнем левом углу под областью.

Затем установите количество полей в X и Y на три на три и нажмите сканировать. Чтобы определить количество ядер кардиомиоцитов, нажмите «Измерить», «Ручное измерение» и «Подсчитать». Отбирайте ядра с сигналами H2B-mCherry, тем самым помечая и подсчитывая их.

Затем выберите альфа-актинин-положительные клетки, чтобы определить количество кардиомиоцитов. Для подсчета кардиомиоцитов фазы G1, S, G2 с ядерными аналиновыми сигналами EGFP выберите измерение, ручное измерение и подсчет. Отметьте ядра EGFP-аналина и экспрессирующие H2B-mCherry щелчком мыши и вручную подсчитайте кардиомиоциты с помощью специфичных для митоза сигналов аналина EGFP, таких как сократительные кольца и промежуточные тела.

Затем нажмите «Измерить», «Ручное измерение» и «Подсчеты», а затем нажмите на кардиомиоциты со специфичными для митоза аналиновыми сигналами EGFP, цитоплазматическими сигналами, сократительными кольцами и средними телами. По сравнению с отрицательным контролем, кардиомиоциты, трансфицированные микроРНК и миРНК, демонстрируют индукцию активности клеточного цикла. Кардиомиоциты, осуществляющие эндоредупликацию, демонстрируют исключительно ядерную экспрессию аналина EGFP, в то время как кардиомиоциты, подвергающиеся делению клеток, демонстрируют экспрессию аналина EGFP в типичных локализациях М-фазы.

После ферментативного расщепления сердечной ткани на аппарате Лангендорфа предсердия и желудочки могут быть механически разделены и проанализированы независимо друг от друга, что позволяет визуализировать трансгенные желудочковые кардиомиоциты H2B-mCherry с высоким количеством H2B-mCherry положительных двухядерных кардиомиоцитов. Напротив, большинство кардиомиоцитов предсердий являются одноядерными. Ферментативное расщепление не приводит к тому, что 100% одноклеточная популяция выявляет паттерн перекрестной полосатости путем окрашивания альфа-актинина, что еще больше облегчает различение между двухядерными кардиомиоцитами в виде непрерывного паттерна перекрестной полосатости и клеточных дублетов.

Для анализа индекса бинуклеации кардиомиоцитов в толстых срезах необходимо вручную прокручивать стопку, так как ядра не обязательно лежат в пределах одной Z-плоскости, при этом окрашивание агглютинином зародышей пшеницы позволяет обнаружить клетку borders. 3D реконструкции фиксированных срезов трансгенных мышиных сердец позволяют обнаружить и автоматизировать подсчет крючков. окрашенные и H2B-mCherry положительные ядра для определения доли ядер кардиомиоцитов в физиологических условиях в пределах ткани. После освоения диссоциация сердца может быть завершена за два-три часа, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости непрерывной работы для поддержания жизнеспособности клеток на протяжении всего эксперимента. После этой процедуры можно провести скрининг микроРНК или других малых веществ на предмет их эффектов, индуцирующих пролиферацию, в постнатальных кардиомиоцитах.