Эмбрион Микроинъекция и электропорации в хордовых Ciona интестиналис

Общая цель методов транзиторной трансфекции у эмбрионов Ciona заключается в изучении регуляции и функции генов, необходимых для формирования личинок, подобных головастике, используя их инвариантную клеточную линию и компактный геном беспозвоночных, чтобы получить представление о происхождении хордовых беспозвоночных. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области молекулярной генетики, такие как консервативные механизмы программы развития хордовых, которые имеют отношение к исследованиям стволовых клеток и к открытию лекарств. Основное преимущество этой методики заключается в том, что с помощью электропорации эмбрионов вы можете обрабатывать сотни или тысячи синхронизированных эмбрионов за один день.

Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности из-за дехорионации хрупкого эмбриона, а также из-за того, что сложно разработать эффективную технику микроинъекций. Начните с препарирования взрослых особей Сионы в комнате для эмбрионов, охлаждаемой при температуре 18 градусов по Цельсию. С помощью небольших ножниц сделайте надрез на противоположном конце сифона и на стороне более короткого сифона, под которым проходит яйцевод и сперматозоид

Удлините разрез, чтобы обнажить яйцевод. Затем с помощью кончика ножниц сделайте точный разрез в яйцеводе. Аккуратно надавите на яйцевод закрытыми ножницами и снимите яйца.

Дайте яйцам опуститься прямо в шестилуночную тарелку с искусственной морской водой с HEPES. С помощью пастеровской пипетки, предварительно промытой ASWH, соберите и перенесите оставшиеся яйца. Чтобы собрать сперму, разрежьте ножницами семявыводящий проток, затем с помощью отдельной пастеровской пипетки соберите концентрированную сперму и переложите в пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Активируйте сперматозоиды, соединив один миллилитр ASWH и 50 микролитров Tris в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров. Затем добавьте 20 микролитров концентрированной спермы, закройте крышку и аккуратно перемешайте, перевернув пробирку, или с помощью пастеровской пипетки. Затем добавьте от 100 до 200 микролитров активированного раствора сперматозоида в каждую лунку с яйцеклетками и хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз, чтобы яйцеклетки плавали в среде.

Начните дехорионацию со сбора зигот и распределения их по стеклянным пробиркам. С помощью ручной центрифуги вращайте зиготы со скоростью 1200 G в течение примерно 20 секунд, затем медленно остановите центрифугу. Удалите ASWH из гранул с помощью пастеровской пипетки.

Добавьте четыре миллилитра активированного раствора дехорионации к грануле в каждой пробирке. Подвешивайте зиготы, осторожно пипетируя вверх и вниз с помощью обработанной водопроводной водой пастеровской пипетки, увенчанной небольшой резиновой грушей. Раствор должен стать желтоватым через 1 – 3 минуты.

Во время дехорионации удалите небольшую аликвоту дехорионирующей суспензии с помощью пастеровской пипетки. Положите каплю на предметное стекло и понаблюдайте за ней под микроскопом. Пипетируйте зиготную суспензию вверх и вниз и проверяйте ползунок каждые 20-30 секунд.

Сначала клетки фолликула отделяются, затем хорион становится желтым и непрозрачным, и, наконец, он отделяется от зигот. Розовые дехорионированные зиготы опустятся на дно стеклянной трубки. Как только более 50% зигот будут дехорионированы, заполните трубку ASWH.

Очень осторожно центрифугируйте в течение примерно 10-15 секунд, ровно столько, сколько нужно для осаждения дехорионированных зигот. Медленно остановите центрифугу. Удалите почти всю жидкость из стеклянной трубки, включая любой плавающий материал, и замените ее ASWH.

Медленно проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы промыться, а затем аккуратно центрифугируйте, как и раньше. Промойте еще раз, пока не останется остатков хориона. Под действием силы тяжести осадок смывают до дехорионированных зигот в силиконизированных пробирках объемом 1,5 миллилитров

После отстаивания удалите ASWH вплоть до отметки 100 микролитров на тюбике. Теперь с помощью пастеровской пипетки добавьте 250 микролитров предварительно приготовленной ДНК в растворе маннитола в одну пробирку зигот. Аккуратно перемешайте и сразу же переложите смесь в четырехмиллиметровую электропорационную кювету.

Поместите кювету в держатель электропорации и дайте один импульс продолжительностью 16 миллисекунд при напряжении 50 вольт. Затем удалите зиготы из кюветы с помощью той же пастеровской пипетки и вытолкните их в чашку для культивирования, содержащую свежий, отфильтрованный ASWH. Помешивайте блюдо, чтобы разложить зиготы.

Промойте пипетку в стакане ASWH, а затем переходите к следующему образцу. После элекропорирования всех зигот культивируйте зиготы при температуре от 15 до 20 градусов Цельсия. Установите микроманипулятор в охлаждаемом помещении с температурой 18 градусов Цельсия.

Подсоедините пластиковую трубку и иглодержатель к стеклянному шприцу объемом 10 миллилитров, наполненному минеральным маслом. Заполните трубку и иглодержатель маслом и удалите пузырьки воздуха. Вставьте в иглу инъекционную иглу, содержащую в иглодержателе 0,5 микролитра раствора для инъекций с зеленым жизненным красителем.

И расположите держатель на микроманипуляторе. Отрегулируйте иглодержатель так, чтобы он двигался по прямой линии под углом 45 градусов относительно поверхности. Расположите дехорионированные яйца в небольшой чашке для культур, покрытой агарозной оболочкой, вдоль углубления, чтобы яйца можно было вводить одну за другой под микроскопом для вскрытия.

При необходимости сломайте кончик иглы, аккуратно прижав иглу к куску стекла крышки стекла, помещенному на агарозу. Слегка надавите, чтобы убедиться, что кончик иглы открыт. Вводите неоплодотворенные яйцеклетки одну за другой, сначала вводя иглу в яйцеклетку и слегка отсасывая, чтобы разорвать оболочку яйца.

Затем введите зеленый раствор для инъекций в середину яйцеклетки, максимум на одну треть диаметра клетки. После введения всех яиц извлеките иглу, перенесите введенные, неоплодотворенные яйца в чашку для свежей культуры и инкубируйте при температуре от 15 до 18 градусов Цельсия до оплодотворения. Микроинъекции использовали для изучения регуляции транскрипционного фактора миелина Ciona intestinalis или MyT на стадии гаструлы эмбрионов Ciona.

При мониторинге методом insitu-гибридизации эндогенная экспрессия наблюдается в предшественниках нейронных пластинок шестого ряда у дикого типа. Микроинъекция морфолино для подавления ранних эмбриональных факторов, таких как Forkhead box A, транскрипционный фактор, устраняет общую экспрессию MyT. И наоборот, экспрессия MyT эктопически активируется при пониженной регуляции узла, что позволяет предположить, что узел обычно подавляет экспрессию MyT в этих предшественниках бокового нервного канатика.

Транскрипционный фактор GATAa был помечен меткой Venus и электропорирован в эктодермальные бластомеры с помощью драйвера pfog. Как видно на рисунке, GATAa в основном локализован в ядрах, как и ожидалось для транскрипционного фактора. В то время как экспрессия Венеры вездесуща.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить транзиторную трансфекцию методом электропорации в синхронизированные зиготы Ciona, как обращаться с хрупкими дехорионированными эмбрионами и как найти правильный угол микроинъекции. После своего развития эти методы проложили путь к функциональной геномике. Изучить функцию генов, генные регуляторные сети и сохранить модули развития, важные для формирования тканей и у человека.