Роботизированная Дозирование Техника для ориентации поверхности и Bioprinting клеток

Общая цель этой автоматизированной роботизированной техники дозирования состоит в том, чтобы создать поверхность для топографического наведения клеток, а затем доставить клетки к этим элементам по запрограммированному шаблону, что позволяет контролировать поведение и распределение клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биомедицинской инженерии, например, как поверхностные топологии могут влиять на поведение клеток, как в монокультуре, так и в кокультуре. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он требует меньше времени на программирование и печать шаблона управления ячейкой по сравнению с более устоявшимися методами.

Он также включает в себя этап доставки клеток для контролируемого дозирования. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы поняли, что двумерные узоры клеток, помещенных в гидрогели, могут выиграть от поверхностного наведения. Таким образом, мы разработали эту технику для печати гидрогелей таким образом, чтобы они соответствовали особенностям поверхности.

Этот протокол описывает использование роботизированной системы дозирования с обратным давлением в качестве биопринтера на основе поверхностного травления и экструзии. Чтобы подготовить поверхность из полистирола к травлению и печати, выберите лист полистирола толщиной в один миллиметр. Более толстые листы будут больше гнуться.

Затем обработайте лист кислородной плазмой. Установите регулятор газообразного кислорода на два деления. Затем включите плазменный аппарат и включите вакуумный насос.

Приступайте к программированию машины на 150 Вт и 30 стандартных кубических сантиметров в минуту потока газообразного кислорода, и подвергайте лист воздействию этих условий в течение 10 минут. Затем опорожните камеру, загерметизируйте дверцу и запустите цикл. Далее погрузите обработанный лист в чистую бычью сыворотку плода и инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов с перемешиванием.

После обработки сывороткой вымойте лист три раза с 1X PBS и простерилизуйте лист. После окончательной стирки оставьте лист в духовке при температуре 37 градусов Цельсия для высыхания на ночь примерно на 12 часов. Сначала подготовьте печатный стилус для травления.

С большой осторожностью вставьте текстильную иглу диаметром 1,5 миллиметра в сопло дозирующего шприца до тех пор, пока она не заклинится и не закрепится. При первой попытке создать биопечатную композицию набросайте желаемый узор на миллиметровой бумаге с пронумерованными осями, чтобы получить координаты x, y. Затем введите координаты узора в таблицу.

Затем в программе для печати выберите «Программа», «Добавить программу», а затем «Редактировать», «Добавить точку», чтобы установить программу. Затем скопируйте значения координат x и y из электронной таблицы в программное обеспечение для дозирования печати. Перед каждым запуском калибруйте высоту по оси Z робота, чтобы установить положение контакта щупа.

Сначала выберите опцию «Робот». Затем нажмите «Изменить режим» и включите опцию «Режим обучения». Это позволяет роботу выполнять функцию JOG.

Чтобы выполнить JOG робота, сначала поместите робота в положение по умолчанию, выбрав Robot, Meca Initialize. Затем Робот, ДЖОГ. Затем в слотах x и y введите расстояние в миллиметрах, необходимое для точного размещения стилуса в начале шаблона.

Затем, также в миллиметрах, введите числовое значение в паз z, чтобы поместить щуп или сопло в контакт с поверхностью без изгиба или вдавливания поверхности. Это значение обозначается как начальное значение z. Глубину каждой канавки можно варьировать с помощью высоты z.

Например, глубина прорезанных канавок может быть 40, 80 или 170 микрон. Требуется концентрация и тщательное наблюдение, чтобы найти точку контакта, в которой не будет сгибания щупа или заметного углубления на поверхности. Чтобы обеспечить успех, мы рекомендуем подготовить несколько листов и запустить программу на разной высоте z, чтобы найти идеальную исходную позицию.

Следующим шагом будет определение инструкции печати для каждой из координатных точек. Используйте инструмент Начало линейного дозирования для определения первой точки и начала печати. Используйте команду Line Passing для обозначения промежуточных точек, и, наконец, используйте команду End of Line Dispense, чтобы подать сигнал роботу о прекращении тиража.

Чтобы передать программу роботу, выберите «Робот», «Отправить данные C&T». Затем запустите прогон, выбрав Robot, Changing Mode, Switch Run Mode и переключив настройку на Run. Наконец, начните печать.

Чтобы сделать биочернила, растворите 2% желатина в Alpha MEM с добавлением 10% FBS и 2% антибиотического антимикотика. Поместите среду при температуре 60 градусов Цельсия на два часа, чтобы желатин растворился в среде. Культивируйте клетки для биочернил до 70% конфлюенции в 10-сантиметровой посуде.

Можно использовать любые клетки, реагирующие на поверхностные направляющие признаки, и они должны выражать флуоресцентную метку, чтобы их можно было увидеть в процессе встраивания. Выпустите прикрепленные клетки в суспензию, удалив среду, промыв клетки PBS и покрыв клетки раствором 1X Trypsin-EDTA в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. После нейтрализации трипсина средой соберите клетки в суспензию и гранулируйте их по 1000 г в течение пяти минут.

Опишите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 0,5 миллилитрах среды. После измерения плотности клеток смешайте суспензию с охлажденным раствором биочернил, чтобы получить раствор с пятью миллионами клеток на миллиметр. Затем налейте биочернила, несущие клетки, в подготовленный печатающий шприц, заблокированный колпачком приманки.

Охладите заряженный шприц до четырех градусов Цельсия, чтобы достичь вязкости, пригодной для печати. Затем выньте заряженный и охлажденный шприц, снимите колпачок шприца и прикрепите сопло для печати. Затем присоедините заряженный шприц к системе дозирования и подключите его к линиям давления воздуха.

Для того, чтобы напечатать биочернила на заранее разработанном рисунке, края и линии должны быть четкими. Точная печать фактически достигается за счет оптимизации обратного давления дозатора и игольчатого манометра печатающего сопла. Установите противодавление дозатора на 0,05 мегапаскаль для шприца объемом 10 миллилитров с конической иглой 34-го калибра.

Затем в программном обеспечении установите скорость записи на поверхность полистирольной пленки на уровне пяти миллиметров в секунду. Теперь, следуя запрограммированной схеме, нанесите клеточные биочернила на предварительно протравленные бороздки. После отсадки ячеек дайте листу поинкубироваться в течение 20 минут при комнатной температуре.

Позже накройте напечатанный каркас клеток соответствующей питательной средой и инкубируйте клетки в течение 24 часов, чтобы клетки прикрепились перед дальнейшими экспериментами. Стволовые клетки, посеянные с помощью биопечати в биочернилах, в конечном итоге оседали на поверхности, ощущались и удлинялись вдоль направления незаметно вытравленных линий. Клетки, посеянные в культуральную среду без биопечати, также выровнены по направлению признаков.

Однако они также покрывали всю поверхность, таким образом, биочернила приковывали клетки к напечатанному следу. При посеве на листы без протравленных элементов клетки не показали ориентации или выравнивания. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как точно вытравливать пазы на листе полистирола, а затем точно биопечатать ячейки в пазы.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за два-три часа. Исследователям в области биоинженерии очень полезно выявлять взаимодействия клеточной поверхности в моделях, где требуется анизотропия и позиционирование клеток. Не забывайте, что биочернила содержат живые клетки, и очень важно использовать стерильную технику при печати листов.