Жизнеспособность Bioprinted Сотовые конструктов Использование Три диспенсер декартово принтера

Общая цель данной процедуры заключается в создании жизнеспособных клеточных конструкций со сложной геометрией с помощью 3D-биопринтера. Это достигается путем предварительного выделения стромальных клеток жировой ткани человека из культуры. Затем клетки смешиваются со свежеприготовленными биочернилами на основе окисленного альгината, конъюгированного с RGD.

На заключительном этапе клеточный LA в биоматериале экструдируется с помощью биопечати. В конечном итоге для анализа жизнеспособности, пролиферации и миграции биопечатных клеток используется конфокальная микроскопия. Основным преимуществом данной процедуры перед существующими методами, такими как формирование скаффолда и посев клеток, является то, что наш метод позволяет размещать клетки и клеточные агрегаты непосредственно в тех местах, где они необходимы для формирования ткани.

Процедуру продемонстрирует Сара Грейс Деннис, аспирант моей лаборатории. Начните с высева 350 000 стромальных клеток жировой ткани человека в обработанный флакон T 75 в 15 миллилитрах среды TMEM с низким содержанием глюкозы для экспансии в инкубаторе для культивирования клеток. Когда культура достигнет 80% конфлюэнтности, удалите среду и промойте клетки пятью миллилитрами DPBS без кальция и магния.

Затем инкубируйте клетки в пяти миллилитрах трипсина и DPBS в течение двух минут при 37 °C; после того как клетки открепятся, остановите ферментативную реакцию, добавив три миллилитра среды для культивирования клеток, и перенесите клетки в коническую пробирку объемом 50 мл. Затем центрифугируйте клетки и ресуспендируйте осадок в двух миллилитрах среды для культивирования клеток. После этого подсчитайте количество клеток, перенесите аликвоту в размере 1,3 × 10⁶ клеток в коническую пробирку объемом 15 мл и снова центрифугируйте клетки.

Ресуспендируйте осадок в одном миллилитре свежеприготовленных биочернил, стараясь равномерно распределить клетки по всему водному раствору альгината. Затем перенесите клетки в стерильный трехмиллилитровый шприц, совместимый с принтером, и накрутите стерильный пластиковый наконечник 22-го калибра. Теперь включите биопринтер, компьютеры каждого из дозаторов и рециркуляционную водяную баню.

Вручную установите температуру ванны на 4 °C для механизма позиционирования, а также параметры печати для каждого диспенсера на соответствующем компьютере управления диспенсерами. Установите объем дозирования на 230 нл, количество шагов назад на ноль, а скорость дозирования на 10 мкл/с. Затем откройте программное обеспечение для проектирования и программу для просмотра изображения с USB-камеры на компьютере.

Затем вручную введите координаты для массива из 25 точек (сетка 5x5) с расстоянием 2,4 мм между каплями. Сохраните программу и отправьте ее на робот. Затем поместите чашку Петри с желатином и диоксидом титана на платформу принтера при температуре 4 °C, закройте и заблокируйте дверь камеры.

С помощью программируемого логического контроллера активируйте источники ультрафиолетового излучения для стерилизации камеры. Через 90 секунд откройте камеру и поместите шприц, содержащий суспензию стромальных клеток жировой ткани человека, в первый пистолет; закройте и заблокируйте дверь камеры, затем с помощью программируемого логического контроллера включите систему вентиляции. Подождите 30 секунд для выравнивания внутреннего давления, после чего запустите программу, содержащую геометрическую траекторию и параметры печати, для выполнения всего процесса печати.

Следите за изображением с USB-камеры на компьютере, чтобы убедиться в точности и равномерности печати. Для количественной оценки жизнеспособности биопечатных конструктов погрузите их в свежеприготовленный раствор красителя. Затем поместите конструкты в холодильник на 15 минут в темноту, чтобы краситель зафиксировался.

Затем, используя изображение с конфокального микроскопа, классифицируйте окрашенные конструкции: если клетки выглядят желтыми или зелеными, они считаются живыми; если красными — клетки мертвы. Как показывают эти результаты, биопечать обеспечивает точное и стабильное размещение клеток и гидрогелей в определенных трехмерных позициях с помощью специализированного программного обеспечения. Программное обеспечение определяет местоположение каждой капли и контролирует множество параметров дозирования.

Одним из требований к успешному методу биопечати является сохранение жизнеспособности клеток. Клетки, напечатанные с использованием альгинатного биочернила, как было продемонстрировано, анализировали через один час и через восемь дней после печати: в день ноль 98% клеток оказались зелеными и жизнеспособными, а на восьмой день этот показатель составил 95%. Поскольку красное окрашивание выражено слабо, в обе временные точки наблюдалось мало погибших клеток, что подтверждает пригодность данного альтернативного чернила для биопечати.

Кроме того, чернила из альгината, конъюгированного с RGD, улучшают прикрепление клеток к напечатанным конструкциям, что приводит к усилению распластыванию и пролиферации клеток, что было количественно оценено в трех отдельных областях гидрогеля на нулевой и восьмой дни. Здесь приведено сравнение качества конъюгации RGD-пептида в биочернилах Ginnet по сравнению с использованием одних только биочернил Ginnet на восьмой день. Распластывание клеток, наблюдавшееся в окрашенном образце Ginnet с конъюгированным RGD, свидетельствовало об успешном включении пептида в состав Ginnet — явление, которое заметно отсутствовало в неконъюгированных образцах биопечати после их получения.

Этот метод открыл исследователям в области тканевой инженерии возможность использовать аддитивное производство для создания живых инженерных конструкций.