Жизнеспособность Bioprinted Сотовые конструктов Использование Три диспенсер декартово принтера

Общая цель этой процедуры заключается в создании жизнеспособных конструкций со сложной геометрией с использованием 3D-биопечати. Это достигается путем выделения стромальных клеток жировой ткани человека из культуры. Далее клетки смешиваются со свежеприготовленными окисленными конъюгированными альгинатными биочернилами RGD.

На заключительном этапе клетка LA в биоматериале экструдируется с помощью биопечати. В конечном счете, конфокальная микроскопия используется для анализа жизнеспособности, пролиферации и миграции биопечатных клеток. Основное преимущество этой процедуры по сравнению с существующими процедурами, такими как формирование скаффолда и посев клеток, заключается в том, что с помощью нашей процедуры вы можете непосредственно разместить клетки и клеточные агрегаты именно там, где они должны быть для формирования ткани.

Сегодня эту процедуру будет демонстрировать Сара Грейс Деннис, аспирантка моей лаборатории. Начните с посева 350 000 стромальных клеток жировой ткани человека в обработанную колбу с Т-75 в 15 миллилитрах TMEM с низким содержанием глюкозы для выращивания в инкубаторе для клеточных культур. Когда культура достигнет 80% текучести, удалите среду и промойте клетки в пяти миллилитрах DPBS без кальция и магния.

Затем инкубируйте клетки в пяти миллилитрах трипсина и DPBS в течение двух минут при 37 градусах Цельсия, когда клетки отделятся, остановите ферментативную реакцию с тремя миллилитрами среды для клеточных культур и перенесите клетки в 50-миллилитровую коническую трубку. Далее центрифугируют клетки и повторно суспендируют гранулу в двух миллилитрах среды для культивирования клеток. Затем пересчитайте клетки, перенесите аликвоту в 1,3 раза в 10 из шести клеток в коническую трубку объемом 15 миллилитров и снова поверните клетки вниз.

Суспендируйте гранулу в одном миллилитре свежеприготовленных биочернил, стараясь равномерно распределить клетки по всему водному раствору альгината. Затем загрузите ячейки в стерильный принтер, совместимый со шприцем объемом три миллилитра, и прикрутите стерильный пластиковый наконечник 22 калибра. Теперь включите биопринт, каждый из дозаторов компьютеров и рециркуляционную водяную баню.

Вручную установите температуру ванны на четыре градуса Цельсия для механизма и параметры печати для каждого дозатора на соответствующем компьютере дозатора. Установите объем дозы равным 230 нанолитрам, количество шагов назад равным нулю, а норму выдачи равной 10 микролитрам в секунду. Затем откройте программное обеспечение для проектирования и программу для просмотра дисплея USB-камеры на компьютере.

Затем вручную введите координаты для массива пять на пять точек с расстоянием между каплями 2,4 миллиметра. Сохраните программу и отправьте ее роботу. Затем поместите чашку Петри, содержащую желатин и диоксид титана, на столик принтера с температурой четыре градуса Цельсия, закройте и заприте дверцу камеры.

С помощью программируемого логического контроллера инициализированы источники ультрафиолетового света для стерилизации камеры. Через 90 секунд откройте камеру и зарядите шприц, содержащий суспензию стромальных клеток жировой ткани человека, в пистолет, закройте и заблокируйте дверцу камеры и с помощью программируемого логического контроллера включите систему вентиляторов. Подождите 30 секунд, пока внутреннее давление не уравновесится, а затем запустите программу, содержащую геометрический путь и параметры печати, на протяжении всего процесса печати.

Следите за отображением USB-камеры на компьютере, чтобы убедиться в точности и равномерности печати. Чтобы количественно оценить жизнеспособность биопечатных конструкций, погрузите их в свежеприготовленный раствор морилки. Затем поместите конструкции в холодильник на 15 минут в темноте, чтобы пятно закрепилось.

Затем, используя изображение с конфокального микроскопа, окрашенные конструкции, если клетки кажутся желтыми или зелеными, классифицируют их как живые, если красные, клетки мертвы. Как показывают эти результаты, биопечать способствует точному и последовательному осаждению клеточной помощи и гидрогелей в определенных трехмерных местах с использованием компьютерного программного обеспечения. Компьютерное программное обеспечение определяет расположение каждой капли и контролирует многие параметры дозирования.

Одним из требований успешной методики биопечати является то, что клетки должны оставаться жизнеспособными. Клетки, напечатанные альгиновыми биочернилами, как только что было продемонстрировано, были проанализированы через час и восемь дней после печати, причем 98% клеток выглядели зелеными и жизнеспособными на нулевой день и 95% на восьмой день. Как показывает красное окрашивание, в любой момент времени наблюдалось небольшое количество мертвых клеток, что подтверждает пригодность альтернативных чернил для биопечати.

Кроме того, сопряженные с альгином чернила RGD усиливают прикрепление клеток к напечатанным конструкциям, что приводит к улучшению распространения и пролиферации клеток, что количественно определено в трех отдельных областях гидрогеля на нуле и восьми. Здесь сравнивали качество конъюгации пептида RGD на биочернилах Ginnet с использованием только биочернил Ginnet на восьмой день. Наблюдаемое распространение клеток в образце, окрашенном конъюгированным гиннетом RGD, указывало на успешное встраивание пептида в гиннет, явление, которое заметно отсутствовало в неконъюгированных образцах биопринта после его развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области тканевой инженерии к изучению аддитивного производства как средства сборки живых инженерных конструкций.